一株鵪鶉源雞毒支原體的分離鑒定

劉麗萍 李玉杰 路曉 趙巧雅 盛媛 高月花 郭效珍 胡峰 田野 劉存霞 于可響

摘 要：本研究從發病鵪鶉體內分離出1株支原體，通過菌落形態、pvpA基因的PCR擴增與測序分析，鑒定為雞毒支原體。采用6種抗菌藥物測其最小抑菌濃度（MIC），發現該分離株對泰妙菌素最敏感，MIC達0.00625 μg/mL;其次為酒石酸泰樂菌素、鹽酸強力霉素，對大觀霉素、慶大霉素、卡那霉素的敏感性較差。

關鍵詞：雞毒支原體;鵪鶉;pvpA基因;最小抑菌濃度

中圖分類號：S858.39? ? ? ? 文獻標識碼：B? ? ? ? 文章編號：1673-1085（2021）8-0041-04

雞毒支原體（Mycoplsma gallisepticum，MG）又稱為雞敗血支原體、雞毒霉形體，宿主譜較廣，雞、鵪鶉、火雞等包括野生鳥在內的10多種禽類均可感染，但主要感染雞和火雞，感染雞而引起雞的慢性呼吸道病（chronic respiratory disease，CRD），感染火雞而引起火雞的傳染性竇炎（infectious sinusitis）^[1，2]。該病廣泛分布于世界各地，致死率不高，但會導致家禽產蛋率、孵化率和飼料轉化率降低。臨床上常常繼發或并發于新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、大腸埃希氏菌病等傳染病，導致病情加重，死亡率升高，為家禽養殖帶來很大的經濟損失^[3]。

鵪鶉感染支原體主要表現為呼吸道癥狀，如鼻腔內有分泌物，鼻竇腫脹，有粘性和膿性液體，喉頭和氣管內有粘液，氣囊增厚、渾濁，氣囊間有泡沫樣粘稠液體和黃色干酪樣物^[4]。本試驗從發病鵪鶉中分離到一株雞毒支原體，并測定了分離株的藥物敏感性，以期為臨床給藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 支原體培養基 本研究采用改良Frey氏培養基，購買自北京中海生物科技有限公司。

1.1.2 菌株及病料 雞毒支原體標準株PG31;雞毒支原體SD株，由山東省農業科學院家禽研究所保存。

病料：來自2020年12月山東發生氣囊炎的某鵪鶉廠，無菌取病鵪鶉氣管及肺。

1.1.3 抗菌藥物 鹽酸強力霉素（S17064，上海源葉生物）、泰妙菌素（S24754，上海源葉生物）、酒石酸泰樂菌素（S30996，上海源葉生物）、鹽酸大觀霉素（S7013，上海源葉生物）、慶大霉素（S17024，上海源葉生物）、硫酸卡那霉素（25389-94-0，Ruitaibio）。

1.2 方法

1.2.1 病原核酸檢測 將鵪鶉氣管及肺按1︰5（W/V）比例加入磷酸鹽緩沖液（PBS）碾磨，取碾磨液提取核酸，進行支原體、新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒的檢測。檢測引物見表1。

1.2.2 支原體分離培養及形態觀察 參考之前的資料^[5，6]，無菌條件下采集鵪鶉氣管及肺，加入適量磷酸鹽緩沖液（PBS），碾磨后靜置，取上清加入到改良Frey氏液體培養基中，置于37 ℃恒溫培養箱培養，觀察約5～7 d，待液體培養基由紅色變為橙黃色為培養終點。將培養液接種于固體培養基后，37 ℃恒溫培養箱培養5～7 d，即可得支原體菌落。低倍鏡下觀察菌落形態，挑取低倍鏡下呈“荷包蛋”樣菌落接種于液體培養基培養3～5 d，待培養基變黃后接種于支原體固體培養基，挑單菌落再接種于液體培養基，重復三次，獲得支原體純培養物。

1.2.3 雞毒支原體PCR鑒定 根據NCBI中發表的雞毒支原體pvpA基因序列設計一對特異性引物，MG-F：5-AGAATGCTCATCCAGGTCAAC-3，MG-R：5-GGTGTAGACCATTTGGCATTG- 3，預期擴增產物大小為330 bp。PCR反應程序為：94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環;72 ℃延伸10 min。產物進行瓊脂糖凝膠電泳，同時送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI上進行核酸比對。

1.2.4 顏色改變單位（CCU）測定 將支原體純培養物連續傳代，待穩定傳代后將菌液置于-80 ℃保存備用，參考吳清民^[7]的方法進行活菌濃度測定。首先將改良Frey氏液體培養基分裝于滅菌離心管，1.8 mL/管，共11管，取分離菌液0.2 mL加入離心管中，混勻后取0.2 mL加入到第二管，將培養菌液進行10倍梯度稀釋，一直稀釋至第10管，第11管作為支原體培養基對照，密封好，于37 ℃恒溫培養箱中，每天觀察試管的變色情況。待培養基顏色不再發生變化時，培養基顏色由紅色變為黃色的最高稀釋的試管數就作為待測菌液的顏色改變單位，用CCU/mL來表示支原體的活菌濃度。

1.2.5 藥物最低抑菌濃度（MIC）測定 參考之前的資料^[8]，采用微量稀釋法對6種抗菌藥物進行MIC測定。取96孔細胞培養板，每一排為1組。所有孔中加入100 μL支原體液體培養基，于第1排中加入上述稀釋并除菌的藥液，充分混勻后取100 μL加至第2孔，依次倍比稀釋至第10孔后棄掉多余的100 μL。每排的第1～10孔中各加100 μL稀釋至1×10⁴CCU/mL的菌液。第11孔加100 μL支原體液體培養基作為培養基對照（陰性對照），第12孔加100 μL稀釋至1×10⁴CCU/mL支原體菌液作為支原體生長對照（陽性對照）。密封細胞板，37 ℃恒溫培養箱培養1周，觀察試驗結果。當陽性對照變成黃色，陰性對照不發生顏色變化時，記錄試驗藥物顏色變化的孔數，該藥物濃度即為MIC。同時采用相同方法，選取泰妙菌素、酒石酸泰樂菌素、強力霉素3種藥物，檢測MG陽性菌株SD株和標準株PG31株的MIC。

3 結果

3.1 病原核酸檢測

核酸檢測結果顯示，只有雞毒支原體PCR結果為陽性，其它病原PCR結果為陰性，排除了其它呼吸道病原感染的可能。

3.2 分離培養

從發病鵪鶉體內分離到一株支原體，在液體培養基中培養3～5 d，培養基顏色由玫紅色變為橙黃色，穩定傳代后24 h可變為橙黃色，陰性對照不變色。在固體培養基上培養3～5 d，培養基表面有針尖大小、透明、光滑菌落，低倍鏡下觀察似“荷包蛋”樣，如圖1。

3.3 PCR鑒定

將分離到的支原體進行PCR擴增，產物進行凝膠電泳分析，得到1條約330 bp大小的目的條帶，與預期結果一致。擴增產物測序后，將測序結果在NCBI上進行BLAST比對，發現其與雞毒支原體的同源性最高，在87.85%～98.44%之間，說明該分離株為雞毒支原體，并將其命名為MG1203。

注：M：DL2000 Marker;1：支原體分離株;2：滑液囊支原體;3：雞毒支原體陽性對照;4：空白對照。

3.4 藥物MIC測定

選用6種抗菌藥，分別測定MIC，結果見表2。該分離株對泰妙菌素最敏感，MIC達0.00625 μg/mL，其次為酒石酸泰樂菌素、鹽酸強力霉素，對大觀霉素、卡那霉素、慶大霉素的敏感性較差。相比較SD株和PG31株，分離株MG1203對泰妙菌素、酒石酸泰樂菌素、鹽酸強力霉素的MIC均升高。

4 討論

支原體、新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒等都會引起的鵪鶉呼吸道疾病，臨床上很難鑒別?；灲Y果表明此次鵪鶉發病為支原體引起的。

禽支原體感染在全世界范圍內廣泛存在，主要包括雞毒支原體感染和滑液囊支原體感染，這兩種支原體不僅能感染雞，也能感染其他禽類。本試驗從發病鵪鶉中分離到一株支原體，在改良Frey氏液體培養基中生長能使培養基顏色變黃而不渾濁，在固體培養基上長出“荷包蛋”樣菌落，完全符合支原體生長特性。禽支原體pvpA基因編碼的PvpA蛋白屬于MG的一個粘附因子，該蛋白是一整合于禽支原體膜上的可變蛋白，在不同株系間大小不同，常用于鑒別不同種類的支原體。因此，本試驗根據雞毒支原體的pvpA基因序列設計了一對特異性引物，對分離株進行擴增與測序，經比對，發現該分離株為雞毒支原體。

目前，藥物防治仍是控制支原體感染的主要手段，但是抗生素的濫用也導致了耐藥性的產生。相比較本實驗室保存的雞毒支原體SD株和PG31標準株，本文分離的鵪鶉源MG1203對泰妙菌素、酒石酸泰樂菌素、鹽酸強力霉素的敏感性顯著降低，表明MG1203對這3種藥物產生了耐藥性，這可能與臨床常用這些藥物治療支原體病有關。與之前報道相比較^[9]，MG1203對酒石酸泰樂菌素的MIC明顯升高，對泰妙菌素的MIC差異不大，而對鹽酸強力霉素的MIC降低。因此，及時進行藥物敏感性試驗才能更好的指導臨床用藥。本試驗采用更敏感、可量化的最低抑菌濃度（MIC）試驗對6種常見抗菌藥物進行敏感性試驗，發現該分離株對泰妙菌素敏感性最高，可用于臨床治療。

參考文獻：

[1] Johnson D C， Emory W H， Kleven S H， et al. A Mycoplasma gallisepticum epornitic in turkeys： its epidemiology and eradication[J]. Avian diseases， 1981： 1047-1052.

[2] W calnek， H John Barnes. Disease of poultry[M]. tenth edition. Ames： Iowa state university press， 1997： 235-296.

[3] 王育偉，岳華，張曉暉，等. 雞毒支原體研究概況[J]. 動物醫學進展，2016，37（7）：106-110.

[4] 王金合，王衛東，楊景. 鵪鶉支原體與大腸菌混合感染診治[J]. 甘肅畜牧獸醫，2012，42（03）：27.

[5] 劉玲，管鳳霞，黎敏，等. 二株禽支原體的分離與鑒定[J]. 山東畜牧獸醫，2010，31（4）：17-18.

[6] 郤翠仙，朱天樂，陳合適.雞毒支原體的分離鑒定及藥線試驗[J].中國畜牧獸藥，2011，38（2）：172-174.

[7] 吳清民，楊秀玉，沈志強，等. 雞毒支原體的分離鑒定和最低抑菌濃度測定[J].中國預防獸醫學報，2003，25（4）：71-74.

[8] 丁美娟，盧鳳英，嚴鵬，等. 雞滑液囊支原體不同地區分離株對抗菌藥物的敏感性試驗[J]. 中國獸藥雜志，2015，49（10）：52～55.

[9] 吳春琳，黃寶欽，藍天韻，等. 福建白羽肉雞雞毒支原體的分離鑒定及最小抑菌濃度測定[J]. 中國畜牧獸醫，2021，48（4）：1489-1497.

收稿日期：2021-07-05

作者簡介：劉麗萍（1989-），女，漢，山東高密人，研究實習員，研究生，從事禽病診斷與防控，E-mail：liulping0114@sina.com。

*通訊作者：于可響（1979-），男，漢，山東青島人，副研究員，從事禽病診斷與防控，E-mail：yukx1979@163.com。

將雞蛋加熱后，會發生什么？

雞蛋分成蛋黃、蛋清和蛋殼三層。蛋黃凝固的溫度為68～71℃，蛋清凝固的溫度為62～64℃，煮雞蛋時如果火太大，在蛋黃外面，凝固溫度低的蛋清就會迅速凝固并且變硬，從而阻礙熱量繼續向蛋黃內傳遞，影響凝固溫度較高的蛋黃凝固，使煮出來的雞蛋清熟黃不熟。因此雞蛋應該冷水下鍋，慢火升溫，沸騰后微火煮3～5 min，?；鸷笤俳? min。這樣煮出來的蛋清嫩，蛋黃凝固又不老，蛋白變性程度最佳，也最容易消化。而煮沸時間超過10 min的雞蛋，不但口感變老，維生素損失大，蛋白質也會變得難消化。

但是如果煮沸數個小時甚至時間更長，雞蛋會發生什么樣的變化呢？雞蛋會被煮的過分成熟，蛋殼破碎，內容物變成糊狀物質。

雞蛋中充滿了卷曲的蛋白質分子，加熱后的蛋白質變性，結構發生變化，形成一個三維結構晶格。繼續加熱雞蛋，蛋白質繼續形成交聯，使雞蛋內部變得更加堅硬，蛋清也會釋放出硫化氫，這也是為什么煮過的蛋在蛋黃上也有綠色的薄膜。雖然蛋殼足夠堅固，可以在沸水中堅持一段時間，但不可能永遠存在。

Deb-El Foods公司的食品科學家Shelly McKee表示：“雞蛋的內部結構受到蛋殼和幾層膜的保護，但是如果花足夠長的時間（幾個月）加熱，蛋殼或許就承受不了其中存在的物理或化學變化，最終導致雞蛋破裂，形成糊狀物。但是這些都取決于加熱的時長、蛋殼的變化和加熱所用水的水質。”

（轉自《蛋品世界》）