河蟹顫抖病病原體的實驗室檢測

宮子慧，孫修云

(泗洪縣水產技術推廣站，江蘇 泗洪 223900)

隨著河蟹養殖規模不斷擴大，各種病害也隨之產生，其中顫抖病是較為常見、危害較嚴重的一種，此病又稱“抖抖病”“環爪病”。該病1990年在我國出現，1997年后呈大規模流行，1998－1999年為發病高峰期，3－11月為主要發病季節，嚴重發病地區發病率＞90%，死亡率＞70%，對河蟹養殖業危害巨大(陳愛平等，2011)。螺原體對水生甲殼動物有廣泛的侵染性，除河蟹外，在小龍蝦、南美白對蝦、羅氏沼蝦及青蝦中也相繼發現螺原體病原。筆者以泗洪地區河蟹顫抖病發病塘的病蟹及同塘套養的青蝦為檢測對象，通過對發病樣本肝胰腺中的細菌和肌肉中螺原體進行鑒定，以期為今后研究提供參考。

一、材料與方法

1.實驗材料

(1)河蟹。采樣時間為2020年8月13日，氣溫31℃，水溫27℃，采集來自9例發病塘口的病蟹和兩例同池套養的鮮活青蝦。病蟹的癥狀為反應遲鈍、行動緩慢、吃食減少甚至不吃食，病蟹離水后步足顫抖、環爪、腹部離開地面、附肢極易脫落，青蝦為鮮活、無癥狀樣本。采集的病蟹和青蝦用采樣箱加冰低溫運送到實驗室。

(2)主要試劑。Chel ex 100 sodium f or m購自SIGMA。2×EasyTaq PCR Super Mix購自北京全式金。核酸染料購自生工生物工程(上海)股份有限公司。DL2000 DNA Mar ker購自TaKaRa。螺原體引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。腸桿菌和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒(比色法)(英文名API 20E)、氧化酶試紙購自梅里埃診斷產品(上海)有限公司。動物用藥敏分析試劑板購自南京菲恩醫療科技有限公司。營養瓊脂、TCBS瓊脂、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂購自北京陸橋技術股份有限公司。

2.方法

(1)螺原體DNA的提取及檢測。取0.2克河蟹(青蝦)肌肉組織，用剪刀剪碎，置于1.5毫升離心管內，加入200微升5%Chel ex100螯合樹脂混勻液、20微升10毫克/毫升蛋白酶K溶液，混勻10秒，56℃恒溫金屬浴20分鐘，混勻10秒，99℃恒溫金屬浴8分鐘，12 000轉/分離心4分鐘，上清液即為待測樣品DNA。PCR反應體系為50微升，包括2×EasyTaq PCR Super Mix 25微升、引物F1和F2各2微升、滅菌雙蒸水20微升、DNA模板1微升。引物序列為F1：CGCAGACGGTTTAGCAAGTTTGGG和R1：AGCACCGAACTTAGTCCGACAC。PCR反應程序為：94℃預變性3分鐘、94℃變性3秒、56℃退火15秒、72℃延伸10秒，35個循環，72℃延伸10分鐘，4℃保溫。對擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統對271 bp的特異性靶片段進行檢測。

(2)病原菌的分離、鑒定及藥敏實驗。用滅菌棉簽蘸取河蟹肝胰腺，均勻涂于普通營養瓊脂培養基和TCBS培養基上，分別置于28℃、37℃恒溫培養18～24小時，觀察菌落形態，并挑取單個菌落劃線接種在營養瓊脂平板和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，分別置于28℃、37℃恒溫培養18～24小時。挑取純化過的細菌制成0.5麥氏單位的菌懸液，采用腸桿菌和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒(比色法)系統測定各分離菌株生理生化特性；同時做氧化酶反應實驗，36℃孵育18～24小時，根據判讀表判讀各反應結果，參照API微生物鑒定系統細菌檢索手冊，得到鑒定結果。用南京菲恩醫療科技有限公司的動物用藥敏分析試劑板進行藥敏實驗。

二、結果

1.螺原體PCR檢測結果

螺原體檢測結果見圖1，1～9號為病蟹檢測結果，10～11號為青蝦檢測結果，PCR檢測結果顯示病蟹和青蝦螺原體陽性檢出率為100%。

圖1 螺原體PCR檢測結果

2.病原菌生理生化鑒定

對分離得到的5株細菌進行生理生化檢測，結果判定為河流弧菌、熒光/惡臭假單胞菌、嗜水氣單胞菌-1(細菌編碼：7046104)、嗜水氣單胞菌-2(細菌編碼：7246104)、腦膜膿毒性金黃桿菌，具體生理生化特征見表1。

表1 鑒定試劑條檢測結果

3.病原菌的藥敏實驗結果

5株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度如表2所示。

表2 細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度 毫克/升

三、討論與分析

本次實驗從河蟹顫抖病樣本和同池套養的鮮活青蝦的肌肉中都分離到了螺原體，從病蟹肝胰腺中共分離到5個細菌分離株，并對8種抗菌藥物進行敏感性測定。結果表明，河流弧菌、嗜水氣單胞菌-1和嗜水氣單胞菌-2對紅霉素耐藥，對其余7種抗菌藥物敏感；熒光/惡臭假單胞菌對甲砜霉素、紅霉素耐藥，對氟苯尼考中敏，對其余5種藥物敏感；腦膜膿毒性金黃桿菌對8種藥物均敏感。雖然從病蟹樣本中分離到了細菌，但有可能是河蟹感染螺原體后抵抗力下降的繼發感染，造成河蟹顫抖病的病原應為螺原體。

河蟹顫抖病要以防為主，樹立通過調控養殖生態環境，達到預防疾病發生的目的。池塘每年都要清淤，特別是上一年發生過病害的池塘，保證淤泥厚度小于5厘米，并曝曬池底，用生石灰或漂白粉徹底清塘。放苗后潑灑葡萄糖類產品，以提高扣蟹的活力和抗應激能力，注重飼料的蛋白質含量和維生素的添加，以保證營養的全面。

建立良好的河蟹養殖生態環境，保持水質清新，栽種苦草、輪葉黑藻、伊樂藻、狐尾藻等水草，水草栽種應體現多樣性原則，定期用聚維酮碘等消毒劑消毒水體，高溫季節要加深池水。進入5月定期用乳酸菌、芽孢桿菌、EM菌等微生物制劑改善水體環境，但要注意禁止與抗生素、消毒殺菌藥或具有抗菌作用的中草藥同用。要盡早使用微生物制劑，通過有益菌的大量繁殖，形成優勢種群，與有害微生物競爭附著位置和養分，抑制病原菌的繁殖，微生物制劑也可以加速環境中有機質的分解，改善水質環境，保持水體清新。