針刺療法干預RANKL／OPG信號通路調控骨質疏松模型大鼠骨代謝平衡機制研究

尹 秦，潘 虹，丁小娟，秦曉光，郭小榮

甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州730020

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是骨量減少、骨微結構退化導致的骨質變化、骨脆性增加，從而極易引發骨折的全身代謝性疾病［1］。研究表明，OP的發生是免疫系統、內分泌系統等多系統共同作用的結果［2-3］。基于中醫學“腎主骨”“脾主運化”理論，OP與脾腎之氣的強弱密切相關，脾胃健旺，則腎精氣充足，骨骼強盛。研究表明，針刺能夠改善骨微結構，促進成骨細胞生成［4］，針刺腎俞穴、三陰交穴、關元穴及足三里穴可培腎壯骨，固精培元［5-8］，這對骨質疏松的發生、發展具有重要影響，但相關機制并不明確。RANKL／OPG信號通路是由核因子Kappa B受體活化因子配體（receptor of activator nuclear factor-kB ligand，RANKL）和骨保護素（osteoprotegerin，OPG）構成。RANKL／OPG信號通路對破骨細胞的形成、分化和吸收具有一定的調節作用，但具體機制并未完全闡明［9-10］。因此，本研究通過切除雌性大鼠雙側卵巢的方法建立OP大鼠模型，給予電針刺激腎俞穴、三陰交穴、關元穴、足三里穴，旨在探究針刺對去卵巢大鼠RANKL／OPG信號通路的作用，并分析其對骨代謝平衡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性Wistar大鼠60只，3月齡，體質量（180±20）g，由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（甘）2019-0001，適應性喂養1周后開始實驗造模。本實驗方案經甘肅中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（批準號：2019010），實驗過程及操作均遵守國家健康與醫學研究委員會動物道德準則。

1.2 主要實驗試劑及儀器

無菌針灸針（北京漢醫醫療器械有限責任公司，規格：0.20 mm×25 mm）；HANS-200A電針儀（南京濟生醫療科技有限公司）；戊酸雌二醇片（拜耳醫藥保健有限公司，規格：1 mg×21片，批號：H20160679）；RANKL抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0747R-1）；OPG抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0431R-1）；酶聯免疫檢測儀（美國BIO-RAD公司）；實驗動物微型CT影像系統（德國西門子公司，型號：Inveon）；倒置相差熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；骨密度儀（韓國Osteosys公司，型號：EXA-PRESTO）；骨特異性堿性磷酸酶（bone specific alkaline phosphatase，BALP）ELISA檢測試劑盒、核結合因子-α1（core-binding factor α1，CBF-α1）ELISA檢測試劑盒、Ⅰ型膠原羧基末端肽（cterminal typeⅠcollagen telopeptide，CTX-I）ELISA檢測 試劑盒、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（procollagen typeⅠamino-terminal peptide，PINP）ELISA檢 測 試 劑 盒、骨鈣素（osteocalcin，OC）ELISA檢測試劑盒均購自北京方程生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型制備60只大鼠按照隨機數字法分空白組、模型組、雌二醇組及針刺組，每組15只。適應性喂養1周后，除空白組外，其他大鼠均去除卵巢，建立OP型大鼠［11］，造模組大鼠骨密度較空白組顯著降低時即造模成功［12］。

1.3.2 干預方法 造模后進行為期12周的干預，參照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”進行換算。空白組、模型組大鼠給予0.9% NaCl溶液50 μg／（kg·d）灌胃，雌二醇組給予戊酸雌二醇50 μg／（kg·d）灌胃，針刺組采用自制鼠袋固定大鼠，暴露針刺穴位，參照《實驗針灸學》取穴方法選擇腎俞穴、三陰交穴、關元穴、足三里穴［13］，將針灸針刺入穴位后，接電針儀，疏密波，刺激強度2 mA，頻率2 Hz，15 min／次，1次／d，共治療12周。4組大鼠均常規飼養，生長環境及飼養條件相同。

1.4 觀察指標

1.4.1 骨代謝標志物含量測定 經腹腔麻醉后處死大鼠，心臟取血2 mL，置于離心機中，離心半徑10 cm，轉速3 000 r／min，離心10 min，取上清液，ELISA法檢測血清中BALP、CTX-Ⅰ、CBF-α1、PINP、OC含量水平。

1.4.2 骨密度及骨小梁微結構測定 分離4組大鼠右側股骨標本，置于Micro-CT下對遠端干骺端進行掃描，設定掃描參數為：65 kV，384 mA，分辨率18 μm。所有標本從股骨遠端生長板頂點至皮質部分去掉后為本次掃描興趣區域（region of interest，ROI），提取圖像資料，自帶骨骼分析軟件（Advanced Bone Analysis，ABA）測定骨組織相關計量學指標，包括：骨密度（bone mineral density，BMD）、相對骨體積（relative bone volume，BV／TV）、骨小梁厚度（trabecular bone thcikness，Tb.Th）、連接密度（connectivity density，Conn.D）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、結構模型指數（structure model index，SMI）。所有CT操作、圖像構建及統計分析均由同一組研究人員操作完成。

1.4.3 TUNEL法檢測股骨遠端細胞凋亡情況 取4組大鼠股骨組織剪碎后置于4%多聚甲醛溶液內浸泡24 h，不同濃度乙醇按順序脫水后，進行切片操作，脫蠟后將標本置于蘇木精中進行染色15 min，最后脫水透明10 min，TUNEL試劑盒檢測4組大鼠切片標本中細胞凋亡情況，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4.4 RT-PCR法檢測RANKL／OPG mRNA表達提取4組大鼠下丘腦及股骨部分組織，使用RNA抽提試劑盒提取不同組大鼠股骨組織中總RNA，檢測RNA純度含量后用Takara逆轉錄試劑盒反轉錄獲取cDNA，應用Primer 5.0設計引物序列，RT-PCR法檢測4組大鼠不同組織中OPG和RANKL mRNA表達量，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參對照，采用2-ΔΔCt方法分析數據。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.4.5 免疫印跡法檢測RANKL／OPG蛋白表達 大鼠處死后，迅速取下丘腦及股骨遠端的部分組織剪碎，加入RIPA裂解緩沖液放置在冰上30 min，分別提取4組大鼠相應組織中的總蛋白，然后使用BCA蛋白測定試劑盒測定各組大鼠皮膚中蛋白質的濃度。蛋白質用SDS-PAGE進行等量分離，然后移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PDVF）膜上，并置于4℃下添加一抗（1∶500）孵育過夜。洗滌后添加辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶500），常溫下孵育2 h。使用ECL試劑進行顯影，應用Quantity One軟件分析蛋白相對表達水平。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料服從正態分布，數據以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性時用LSD-t法進行檢驗，方差不齊采用Tamhane's T2進行檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組干預后骨密度及骨代謝標志物比較

與空白組比較，模型組、雌二醇組、針刺組BMD、BALP、CBF-α1、CTX-I、PINP、OC均明顯低于空白組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，針 刺 組BMD、BALP、CBF-α1、CTX-I、PINP、OC均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 4組干預后BMD及骨代謝標志物含量比較（±s）Table 2 Comparison of BMD and bone metabolic markers in four groups after intervention（±s）

表2 4組干預后BMD及骨代謝標志物含量比較（±s）Table 2 Comparison of BMD and bone metabolic markers in four groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

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2.2 4組干預后骨小梁微結構比較

與空白組比較，模型組BV／TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均明顯降低，Tb.Sp、SMI均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，雌二醇組針 刺組BV／TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均 明 顯 升高，Tb.Sp、SMI均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4組干預后骨小梁微結構比較（±s）Table 3 Comparison of trabecular microstructure in four groups after intervention（±s）

表3 4組干預后骨小梁微結構比較（±s）Table 3 Comparison of trabecular microstructure in four groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

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2.3 4組股骨遠端細胞凋亡情況比較

TUNEL染色提示藍色熒光為正常細胞核，綠色熒光為凋亡細胞。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，空白組大鼠骨組織正常，綠色熒光極少；與空白組比較，模型組凋亡細胞數量明顯增加；與模型組比較，雌二醇組、針刺組干預后大鼠股骨遠端細胞凋亡數量均明顯減少。見圖1。

圖1 4組大鼠股骨遠端細胞凋亡情況比較（×40）Figure 1 Comparison of apoptosis in distal femur in four groups（×40）

2.4 4組干預后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL mRNA表達量比較

與空白組比較，模型組下丘腦、股骨中OPG mRNA均明顯降低，RANKL mRNA均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，針刺組下丘腦、股骨中OPG mRNA均明顯上升，RANKL mRNA均明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 4組干預后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL mRNA表達量比較（±s）Table 4 Comparison of OPG and RANKL mRNA expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention（±s）

表4 4組干預后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL mRNA表達量比較（±s）Table 4 Comparison of OPG and RANKL mRNA expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

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2.5 4組干預后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL蛋白表達量比較

與空白組比較，模型組下丘腦及股骨組織中OPG蛋白表達均明顯降低，RANKL蛋白均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，針刺組下丘腦、股骨中OPG蛋白表達均明顯上升，RANKL蛋白表達均明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 4組干預后下丘腦和股骨組織中OPG、RANKL蛋白表達量比較Figure 2 Comparison of OPG and RANKL protein expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention

表5 4組干預后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL蛋白表達量比較（±s）Table 5 Comparison of OPG and RANKL protein expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention（±s）

表5 4組干預后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL蛋白表達量比較（±s）Table 5 Comparison of OPG and RANKL protein expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

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3 討 論

研究顯示，OP發病與骨組織代謝異常、骨微循環障礙以及基因多態性等多因素有關［14］。隨著人口老齡化加快和激素的過多使用，OP患病率呈現逐年增長趨勢［15］。中醫學將OP歸于“骨痿”“骨枯”范疇，辨證論治多從腎、脾等臟腑入手。張景岳［16］指出：“水谷之海先天為之主，精血之海后天為之資……先天不足者，后天培養之，亦可居其強半。”說明腎精氣充足與脾胃功能密切相關，脾胃健旺，則水谷精微化源充盛，骨骼強盛。

中醫藏象學說認為“腎精生髓，髓通于腦”“諸髓者，皆屬于腦”。可見古代醫家早已認識到腦、腎、骨三者密切的聯系。故當腦生理活動異常時，腎主骨生髓之功能也可能異常，甚至可發展至骨痿。有研究認為，OP是由神經系統、內分泌系統以及免疫系統功能紊亂導致的骨代謝異常［17］，而下丘腦是系統調節的主要調控中心［18］。“腎藏精”在整體層次的主要體現就是對下丘腦的調控作用［19］。隨著個體衰老，機體脾腎漸衰，從而出現“脾腎虧虛”的各種表現，進而導致OP發生發展［20］。因此，臨床亟需尋找有效的方法干預OP，并探討其可能的作用機制。

3.1 針刺可改善OP模型大鼠骨密度，調節骨代謝水平

骨密度是臨床檢測骨質疏松變化的重要指標。本研究結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠的BMD及骨代謝標志物等含量明顯降低，這表明去卵巢大鼠造模后骨量出現丟失，這與骨質疏松的病理表現相符。與模型組比較，針刺組大鼠骨密度含量明顯增加，骨代謝相關標志物水平明顯改善，骨小梁微結構指標明顯改善，這提示針刺可改善OP模型大鼠骨密度，調節骨代謝水平。這與喬梁等［21-22］研究結果一致。PINP作為Ⅰ型前膠原細胞外分泌產物是骨形成的敏感指標，CTX-Ⅰ是骨吸收過程中Ⅰ型膠原釋放入血的產物。PINP、CTX-Ⅰ是診斷骨質疏松癥的特異性指標［23-24］。針刺足三里、三陰交、腎俞、關元等穴位可使血液中PINP及CTX-Ⅰ含量明顯增加，從而提高Ⅰ型膠原的合成速率，促進成骨細胞活動和骨吸收。CBF-α1屬于runt結構域基因家族的轉錄因子，由成骨細胞特異性表達，是決定成骨細胞分化的重要因子。OC主要由成骨細胞、成牙質細胞合成，作為成骨細胞分泌的特殊非膠原蛋白，其含量變化可用于監測骨發育以及骨代謝情況，在調節骨鈣代謝中起重要作用［25］。針刺足三里、三陰交、腎俞、關元等穴位可提高CBF-α1和OC含量，這有助于調節成骨細胞分化，調控骨細胞的功能因子表達，促進骨骼形成和發育［26］。

3.2 針刺調節OP模型大鼠骨代謝平衡可能與RANKL／OPG信號通路調控有關

下丘腦在骨代謝的調控過程中發揮重要作用，而RANKL／OPG信號通路是骨代謝過程中重要的信號通路之一。本研究結果顯示，OP模型大鼠下丘腦及股骨遠端組織中OPG表達下降，而RANKL表達升高，這提示下丘腦可協同調控股骨組織中RANKL／OPG信號通路表達，間接促進骨吸收過程。本研究結果還發現，大鼠造模后RANKL／OPG蛋白和mRNA在下丘腦及股骨遠端組織中表達含量發生明顯變化，但經針刺干預后，OP大鼠下丘腦及股骨組織中OPG mRNA和蛋白表達量明顯上升，RANKL mRNA和蛋白表達量明顯下降，這提示針刺能夠調節OP大鼠RANKL／OPG信號通路的表達，這與魏振樸等［27-28］研究結果一致。維持RANKL／OPG信號通路平衡，能夠調控破骨細胞的生成，控制骨代謝，而在骨代謝過程中下丘腦能夠分泌多種信號因子來調節骨吸收標志物并參與骨重建的過程，骨堿性磷酸酶（BALP）是其中主要的成骨細胞表型標志物之一［29-30］。BALP可誘導成骨細胞分泌RANKL轉導因子，促使組織中的核因子κB（NF-κB）受體活化因子配基調控骨吸收［31］。OPG是由成骨細胞分泌的RANKL餌受體（NF-κB受體活化因子配體），RANK是RANKL的唯一受體，在破骨細胞前體細胞、成熟的破骨細胞和軟骨細胞上均有表達［32］。在BALP影響下，OPG與RANK競爭并結合RANKL，拮抗RANKL-RANK表面相關蛋白的結合，從而導致破骨細胞的分化、成熟能力降低，促使破骨細胞凋亡，抑制骨吸收［33］。針刺足三里、三陰交、腎 俞、關元等穴位可提高BALP含量，促進RANKL／OPG信號通路表達，促進骨吸收作用，增強骨小梁結構強度，提高骨密度，從而改善骨微結構，進而影響骨質疏松發病進程［34］。

4 小 結

針刺腎俞、三陰交、關元、足三里等穴位能夠改善OP模型大鼠骨代謝標志物表達，調控骨代謝平衡，其機制可能與針刺調控RANKL／OPG信號通路表達有關。