基于網絡藥理學和分子對接探討白花蛇舌草治療骨肉瘤的作用機制

劉 沁，段辛威，李西海

1香港大學深圳醫院，廣東 深圳518053；

2福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122；

3福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州350122

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種多發于兒童和青少年的侵襲性原發性骨惡性腫瘤，其確切病理、生理機制尚不明確。當前臨床主要采用新輔助化療加手術的方式進行治療，患者生存率仍不理想，且尚無有效的系統療法來應對復發或轉移性骨肉瘤［1］。尋找新的骨肉瘤干預藥物是當前亟待解決的臨床和科研問題。中醫藥緩解惡性腫瘤臨床癥狀和放化療增效減毒等方面效果明顯［2］，白花蛇舌草具有清熱利濕和解毒消癰的功效，其各部位及其黃酮類、三萜類、香豆素類和多糖類提取物或制劑可在增殖、侵襲、耐藥等方面對骨肉瘤發揮不同的作用［3-5］，但具體作用機制尚不完全明確。因此，利用網絡藥理學和分子對接方法研究白花蛇舌草對骨肉瘤干預的分子作用機制，有助于為骨肉瘤臨床用藥及白花蛇舌草的開發利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 白花蛇舌草活性成分篩選和靶點預測

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology data-base and analysisplatform，TCMSP）篩選出與白花蛇舌草相關的化合物和靶基因，并設置生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件［6］，篩選出有效成分，同時在該數據庫中檢索出符合要求的成分靶基因，并刪除重復靶基因，將篩選出的靶基因作為白花蛇舌草的預測靶基因。

1.2 骨肉瘤相關基因及白花蛇舌草治療靶點預測

利用GEO-NCBI數據庫中GEO Datasets子集，篩選出骨肉瘤相關基因表達測序芯片，選取3個表達顯著的芯片GSE28424、GSE19276、GSE16088，利用log 2算法對基因數據整理，篩選出3個芯片中的差異基因，將3個芯片中至少同時存在于2個及以上芯片的差異基因與Genecards數據庫、孟德爾OMIM數據庫、PharmGKB數據庫、Drugbank數據庫、TTD數據庫檢索到的骨肉瘤相關基因取并集作為骨肉瘤疾病基因數據集。

通過Perl語言編輯分析，將白花蛇舌草預測的靶基因與骨肉瘤疾病基因取交集，從而得到白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因，通過這部分交集基因構建起白花蛇舌草-骨肉瘤的分子機制層面聯系。

1.3 白花蛇舌草活性成分-骨肉瘤靶點調控網絡構建

采用Cytoscape 3.8.1軟件將白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因與藥物成分分別導入，將骨肉瘤靶基因、白花蛇舌草主要有效成分進行可視化編輯，構建白花蛇舌草干預骨肉瘤活性成分-靶點網絡。

1.4 蛋白相互作用網絡構建及核心靶點篩選

將白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因導入STRING構建蛋白互作網絡，并將其保存為tsv文件。采用Cytoscape 3.8.1軟件打開文件，在PPI網絡的基礎上進行拓撲分析，即選取介數中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、局部邊連通性（local average connectivity-based method centrality，LAC）、網絡中心性（network centrality，NC）6種拓撲參數進行分析［7］。以各項拓撲參數值均＞中位數值作為篩選條件，即可得到關鍵基因。

1.5 生物信息學分析

將白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因用基于R語言的、面向基因組信息分析的Bioconductor軟件合集對白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因進行基因本體論（gene onotology，GO）分析、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

1.6 分子對接分析

選擇PPI拓撲分析篩選出的核心網絡上的靶基因及其對應的活性成分進行分子對接，在Pubchem數據庫查找白花蛇舌草活性成分2D構象，用ChemBio3D Ultra 14.0.0.117軟件轉換為3D結構并優化最小自由能，使用PDB數據庫查找靶蛋白，導入PyMOL 2.4.1軟件，去除水分子、分離原有配體，然后導入AutoDockTools 1.5.6軟件，使對接位點選擇以原有配體為中心，設置網格箱（gird box）為默認值，運用Vina進行分子對接，獲得白花蛇舌草中活性分子與靶蛋白的對接結果，將對接結果輸出為txt文件和pdbqt文件，打開txt文件查看對接結果，用PyMOL 2.4.1打開查看對接圖像。一般認為當結合親和力（binding affinity）＜-4.25 kcal／mol時說明活性分子與靶蛋白有一定的結合活性，結合親和力＜－5.0 kcal／mol時有較好的結合活性，結合親和力＜－7.0 kcal／mol時有強烈的結合活性［7］。

1.7 引用和參考的數據庫

見表1。

表1 參考數據庫Table 1 Collections of database

2 結 果

2.1 白花蛇舌草中有效活性成分的篩選和靶點預測結果

根據篩選條件OB≥30%、DL≥0.18從TCMSP數據庫篩選出7個白花蛇舌草有效成分，見表2。7個有效成分中，2個成分（MOL001646 2，3-甲氧基-6-甲氧基蒽醌、MOL001663 3-表齊墩果酸）靶基因數據缺失，其余5個成分（MOL001659多孔甾醇、MOL001670 2-甲氧基-3-甲基-9，10蒽醌、MOL 000449豆甾醇、MOL000358β-谷甾醇、MOL000098槲皮素）共有靶基因169個，見表3。

表2 白花蛇舌草主要有效成分Table 2 Main effective components of Hedyotis diffusa

表3 白花蛇舌草靶基因Table 3 Target genes of Hedyotis diffusa

2.2 骨肉瘤相關基因及共同靶點

骨肉瘤相關基因篩選如下：GEO-NCBI數據庫1 376個、Genecards數據庫1 904個、孟德爾OMIM數 據 庫4個、PharmGKB數 據 庫94個、Drugbank數據庫2個、TTD數據庫7個，刪除重復值后得到3 178個骨肉瘤相關基因，見圖1。將169個白花蛇舌草靶基因和3 178個骨肉瘤相關基因取交集，得到98個白花蛇舌草-骨肉瘤共同靶基因，這98個靶基因即為白花蛇舌草治療骨肉瘤的潛在靶點。

2.3 白花蛇舌草活性成分-骨肉瘤靶點網絡

通過Cytoscape 3.8.1軟件將得到的5個有效成分和98個白花蛇舌草-骨肉瘤靶基因構建可視化調控網絡，其中MOL001670可調控5個靶基因、MOL000449可調控10個靶基因、MOL000098可調控91個靶基因、MOL000358可調控13個靶基因、MOL001659可調控2個靶基因，有16個靶基因至少被2種及以上有效成分調控，見圖2。

2.4 共同靶點蛋白相互作用網絡及核心靶點篩選

將98個交集基因導入STRING數據庫，設置物種為Homo sapiens，并設置medium confidence為0.900，去除游離節點，得到“白花蛇舌草-骨肉瘤”的PPI網絡，該網 絡由84個 節 點（Node）、316條 邊（Edge）構成，見圖3。PPI核心網絡由8個節點和51條邊組成，見圖4。篩選出核心基因8個，分別是雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、JUN、RAC-α絲氨酸／蘇氨酸-蛋白激酶（RAC-alpha serine／threonine-protein kinase，AKT1）、G1／S特 異 性細胞周期蛋白-D1（G1／S-specific cyclin-D1，CCND1）、FOS、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、細胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、MYC。見表4。

圖4 篩選PPI網絡中的核心基因Figure 4 Screening core genes in the PPI network

2.5 生物信息學分析

將98個交集基因進行GO富集分析和KEGG富集分析。

2.5.1 GO功能富集分析GO富集分析得到P＜0.05的GO條目共計2 205條，具體包括以下：①生物進程（biological process，BP）結果2 037條，包括細胞凋亡負調控、對脂多糖的反應、細胞凋亡信號通路的調控等；②細胞組分CC（cellular components，CC）結果39條，包括膜筏、膜微域、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物、轉錄調節因子復合體、核染色質、細胞周期素-依賴性蛋白激酶全酶復合物等；③分子功能（molecular function，MF）結果129條，包括泛素樣蛋白連接酶結合、DNA-結合轉錄因子的結合、泛素蛋白連接酶結合、DNA-結合轉錄激活子活性、核受體活性、DNA-結合轉錄激活子活性和RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA-結合轉錄因子結合等，各類前10的結果見圖5。

圖5 GO富集分析結果圖Figure 5 Results of GO enrichment analysis

2.5.2 KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析得到P＜0.05的通路155條，主要富集在包括前列腺癌通路、膀胱癌通路、胰腺癌、小細胞肺癌、IL-17信號通路、細胞凋亡、腫瘤壞死因子信號通路、p53信號通路、細胞衰老等通路上，前30條通路結果見圖6。

圖6 KEGG富集結果圖Figure 6 Results of KEGG enrichment

2.6 分子對接及結合自由能分析

本 研 究 選 取 核心 靶 點（ESR1、JUN、AKT1、CCND1、FOS、MAPK1、TP53、MYC）和白花蛇舌草的3個有效成分進行分子對接，以驗證白花蛇舌草活性成分與靶點的對應關系，通過結合自由能判斷分子間的結合能力。結果顯示，9組對接結果中結合能均＜－7 kcal／mol，見表5、圖7。

圖7 分子對接三維圖Figure 7 Three dimensional view of molecular docking

3 討 論

骨肉瘤在中醫學里屬“石癰”“石疽”“石巖”等范疇，其病因病機是本虛標實，正氣虧虛為本，痰濁瘀濕為標［8］。先天腎氣虧虛，骨失所養使邪毒趁虛內侵于骨、痰瘀內生致邪毒閉郁在骨、外感邪毒內傷于骨都可導致骨肉瘤發病［9］。白花蛇舌草有清熱利濕、解毒消癰、祛濕散結的功效，在國家名老中醫抗腫瘤用藥規律研究中，白花蛇舌草的使用頻次居前5名［10］，如由白花蛇舌草、炙黃芪等組成的清解扶正顆粒在對大腸癌的臨床治療上療效確切［11］。有研究表明，白花蛇舌草對骨肉瘤增殖、侵襲、耐藥都有一定干預作用［4，12］，但具體作用機制有待進一步探明。

本研究通過對篩選出的98個白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因進行分析，PPI分析得到ESR1、JUN、AKT1、CCND1、FOS、MAPK1、TP53、MYC 8個度值最高的核心靶點，可能是白花蛇舌草干預骨肉瘤潛在靶點。GO富集結果顯示，交集基因BP主要富集在對細胞凋亡信號通路的調控、對類固醇和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）反應以及氧化應激反應等生物進程上，其中對細胞凋亡信號通路的調控這一生物進程富集了包括TP53和AKT1在內的25個基因，LPS就可通過cAMP／PKA通路上調髓樣樹突狀細胞中IL23表達，從而促進骨肉瘤進展［1］。CC主要富集在膜性結構、轉錄調節復合物、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物和線粒體等細胞組分上，其中轉錄調節復合物這一細胞組分上富集了包括JUN、CCND1、FOS、TP53在內的15個基因，JUN與FOS可形成核內轉錄因子二聚體AP-1介導轉錄，此外，這也可能與線粒體凋亡途徑和膜電位極化有關；MF主要富集在轉錄因子活性上，這與CC富集結果相一致。KEGG富集結果顯示，基因主要富集在膀胱癌和小細胞肺癌等癌癥、p53、鉑基耐藥、細胞凋亡等通路上，度值排名前3的通路是膀胱癌、前列腺癌和糖尿病并發癥AGE-RAGE。其中p53信號途徑的上調對骨肉瘤的阿霉素化療具有促凋亡和提高藥物敏感性作用［13］，曲古菌素A通過p53信號通路的激活以劑量依賴的方式促進人骨肉瘤細胞（MG63）細胞凋亡［14］。

本研究對2-甲氧基-3-甲基-9，10-蒽醌、β-谷甾醇、槲皮素3個化合物的分析發現，其可能是白花蛇舌草干預骨肉瘤的主要成分。其中甾醇類（β-谷甾醇）和蒽醌類（2-甲氧基-3-甲基-9，10-蒽醌）對骨肉瘤作用機制未見報道，但2-甲氧基-3-甲基-9，10-蒽醌的靶點ESR1與β-谷甾醇的靶點JUN都和骨肉瘤密切相關。槲皮素作為白花蛇舌草中的黃酮類主要成分，對骨肉瘤的干預具有多渠道、多靶標的作用特點。一方面，通過改變骨肉瘤細胞周期，將細胞周期阻抑在S期以抑制增殖和誘導凋亡。另一方面，通過下調甲狀旁腺激素受體1（PTHR1）和Bcl-2、上調miRNA-217和BAX提高骨肉瘤放化療敏感性；還可上調ROS-NUPR1通路增加自噬通量、促進線粒體去極化、改變活性氧濃度來抑制骨肉瘤增殖［15-17］。分子對接結果驗證了白花蛇舌草核心分子與靶標蛋白具有很好的結合作用。

骨肉瘤的發生是一個包含增殖、浸潤、轉植的多階段多反應過程，8個核心基因都參與了這一過程。其中MAPK、JUN、FOS、CCND1、TP53這5個蛋白可形成信號傳導級聯，內外源信號傳遞至MAPK后，MAPK作為一條入核通路上的關鍵蛋白可將信號傳遞給核內JUN和FOS，如MAPK家族JNK可磷酸化c-JUN［18－19］。①JUN家族蛋白可在家族內或與FOS家族蛋白形成二聚體，如c-JUN和c-FOS形成核內轉錄因子二聚體AP-1［20］，AP-1與具有結合位點的基因啟動子或增強子結合調節相關基因表達。②JUN和FOS也參與細胞周期調控，兩蛋白家族中不同蛋白對細胞周期具有不同的調節作用，如c-JUN可激活CCND1對細胞周期起到正向調節作用，而JUN B則抑制CCND1激酶活性從而延遲G1期。③JUN可調節抑癌基因TP53編碼的蛋白p53［21］及其效應因子p21從而擾亂細胞周期［22-24］，而p53異常表達（如突變等）常與上皮細胞惡性轉化及骨肉瘤和其他腫瘤惡性預后相關［25］。因此，從這5個靶蛋白入手干預骨肉瘤都取得了良好干預效果。如micRNA-15a、micRNA-16-1和micRNA-466可靶向下調CCND1阻抑骨肉瘤細胞周期［26］，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖；而lncRNA FLVCRAS1則通過靶向下調miRNA381-3p來增加CCND1表達，從而促進骨肉瘤增殖［27］；三氧化二砷（As2O3）聯合阿霉素（ADM）可通過MAPK通路抑制微管不穩定蛋白介導的骨肉瘤侵襲［28］。此外，MYC、ESR1、AKT1、MAPK1在骨肉瘤組織或細胞中的表達高于正常水平，通過micRNA、上下游效應因子或抑制劑下調4個基因表達的效應水平可降低骨肉瘤侵襲性，阻抑骨肉瘤進展［29－34］。ESR則在骨肉瘤及阿霉素耐藥細胞株中都過表達，ESRα的高表達能增加骨肉瘤細胞對阿霉素的耐藥性［35］。

4 小 結

本研究從網絡藥理學和分子對接的角度證實了白花蛇舌草能通過多成分、多靶點、多途徑對骨肉瘤進行干預，作用機制主要體現在干預骨肉瘤增殖、侵襲和耐藥等方面，為白花蛇舌草在骨肉瘤的臨床使用提供依據。下一步研究可以通過液-質聯用色譜等方法鑒別白花蛇舌草的活性成分，并通過實驗驗證網絡藥理學篩選出來的關鍵靶點和反應級聯，從而為白花蛇舌草在骨肉瘤中的應用提供進一步依據。