神經干細胞聯合神經生長因子納米粒海馬移植對阿爾茨海默病轉基因鼠的影響

朱 清，邵 帥，胡 楠，陳 艷*

1廣州醫科大學附屬第二醫院，廣東 廣州510260；

2荊門市第二人民醫院，湖北 荊門448000

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿且進行性進展的神經系統退行性疾病。有研究顯示，早在β-淀粉樣蛋白（amyloid betaprotein，Aβ）沉積之前，AD患者腦內已存在膽堿能神經元受損和基底前腦膽堿能神經元的損傷，導致支配海馬和皮層膽堿能纖維減少，這是引起AD患者認知功能減退最重要的原因［1］。研究表明，神經干細胞（neural stem cell，NSC）移植可通過不同的機制改善AD模型鼠的認知功能。但是，外源性NSC移植到腦內的存活率及其分化命運無法掌控。神經生長因子（nerve growth factor，NGF）是一種重要的神經營養因子，其可影響體內外正常NSC甚至AD腦內異常NSC的存活、增殖和分化［2］，并在膽堿能神經元表型的維持上發揮不可替代的作用［3］。但NGF作為一種大分子蛋白質，無法透過血腦屏障，半衰期短，其在腦內的應用具有一定局限性。本課題組前期研究結果顯示，聯合NGF納米粒移植可促進移植NSC存活，增加海馬突觸素（synaptophysin，SYP）的表達，最終改善AD小鼠的認知功能［4］。本研究采用復乳化溶劑擴散法制備NGF納米粒，改變NGF的膜轉運機制，使其可以透過血腦屏障，通過NGF納米粒聯合NSC移植治療APP／PS1轉基因AD小鼠，觀察移植細胞的存活和分化，探討NSC移植對基底前腦膽堿能神經元及海馬、皮層Aβ斑塊的影響，為分析細胞移植治療AD小鼠認知功能障礙可能的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5月齡SPF級雄性APP／PS1轉基因AD小鼠45只，體質量25～35 g，購自廣東省實驗動物中心及南京生物醫藥研究所［許可證號：SCXK（粵）2013-0002；SCXK（蘇）2015-0001］。購買后用普通飼料飼養至12月齡，飼養過程中因疾病等原因淘汰9只，最終納入36只。5月齡SPF級雄性野生型小鼠（wild type，WT）16只，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心［許可證號SCXK（粵）2013-0034］，飼養至12月齡，選12只納入本研究。廣泛表達增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）C57BL／6-轉基因雌性小鼠3只，購自南京大學-南京生物醫藥研究院［許可證號：SCXK（蘇）2015-0001］，購回后交配育種，取孕12.5～14.5 d的胎鼠腦提取NSC。

1.2 實驗試劑

杜氏改良培養基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM／F12）、B27添加劑、神經基礎培養基（Neurobasal）（美國Gibco公司）；青-鏈霉素溶液（美國Sigma公司）；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、NGF（美國PeproTech公司）；硫磺素T試劑（美國Sigma公司）；RT-PCR反轉錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒（Takara公司）；鼠抗膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）一抗（Affinity Biosciences公司）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗（博奧森生物科技公司）；鼠抗β-tubulinⅢ一抗、鼠抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、鼠ChAT抗體（Abcam公司）；兔抗雙腎上腺皮質激素（doublecortin，DCX）抗體（Cell Signaling Technology公司）；羊抗小鼠Alexa FluorTM568、驢抗兔Alexa FluorTM594（Thermo Fisher公司）。所用引物由Invitrogen公司合成，引物序列為：①βactin：上游5'-GTTACAGGAAGTCCCTCACCC-3'，下游3'-CAGAAGCAATGCTGTCACCTT-5'。②Lhx8：上游5'-ACACGAGCTGCTACATTAAGGA-3'，下游3'-CCAGTCAGTCGAGTGGATGTG-5'。③ChAT：上游5'-GGCCATTGTGAAGCGGTTTG-3'，下游3'-GC CAGGCGGTTGTTTAGATACA-5'。

1.3 實驗動物分組

36只12月齡雄性APP／PS1轉基因小鼠采用隨機數字表法分為AD對照組、NSC移植組、NSC聯合NGF納米粒移植組（聯合移植組），每組12只。另外選取12只12月齡雄性野生型小鼠作為WT對照組。

1.4 實驗方法

1.4.1 NSC分離及培養

1.4.1.1 NSC分離 孕12.5～14.5 d的EGFP轉基因小鼠麻醉后斷頸處死，取出Y型子宮轉到無菌環境，依次放置于75%酒精、D-Hanks平衡鹽中清洗2次，隨即于預冷的平衡鹽液中剝出胎鼠大腦，小心剝離腦膜及血管（冰上操作），將剝離干凈的腦組織轉入另一預冷DMEM／F12培養液中，剪碎并吹打，經200目無菌濾網過濾后離心5 min，收集細胞（1 000 r／min）。

1.4.1.2 NSC培養DMEM／F12培養液清洗收集細胞，離心后去除上清，加入新鮮配制的神經干細胞增殖培養基（DMEM／F12基礎培養液＋2% B27＋20 ng／mL EGF＋20 ng／mL bFGF＋1%青鏈霉素），吹打混勻計數，調整細胞濃度為1×105／mL，接種于25 mL培養瓶中，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。根據細胞生長狀態2～3 d半量換液，5～6 d傳代，據傳代次數依次記為P1、P2代。

1.4.2 NSC移植 根據小鼠腦立體定位圖譜，確定雙側海馬注射點并做標記：前囟后2.05 mm，旁開1.85 mm，深度2.5 mm。具體移植步驟如下：WT對照組和AD對照組小鼠于雙側海馬注射5 μL無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），NSC移植組注射5 μL NSC懸液（PBS制備1×105／μL NSC細胞懸液），聯合移植組注射5 μL NSC和NGF納米粒懸液（50 ng／mL的NGF納米粒溶液重懸，配制1×105／μL NSC懸液）［5］。移植術后，各組小鼠單籠飼養，自由進食飲水。

1.5 樣本采集

1.5.1 腦切片采集 移植術后4周，每組隨機取6只小鼠灌注取腦行組織切片染色。腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，并固定四肢，充分暴露心臟，快速灌注預冷的0.9% NaCl溶液，再灌注預冷的4%多聚甲醛，斷頭取腦，將腦組織置于4%的多聚甲醛中后固定（4℃，16 h），之后分別在10%、20%、30%的蔗糖溶液中進行梯度脫水，脫水完全的腦組織用OCT包埋劑包埋并快速冰凍后切片，片厚30 μm，放入組織凍存液中保存，用于免疫熒光及硫磺素染色。

1.5.2 腦組織采集 移植術后4周，每組隨機取6只小鼠，頸椎脫臼法快速處死小鼠，取腦，分離出雙側基底前腦，一側置于含Trizol的EP管中，用于RNA檢測；另一側置于蛋白裂解液中（-80℃保存），用于蛋白表達的檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 免疫熒光法檢測NSC存活、遷移、分化及基底前腦ChAT水平 選取海馬及基底前腦部位腦組織切片，PBS洗3次（5 min／次），0.3% Triton-X100室溫孵育15 min后用PBS洗3次（5 min／次）；5%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉2 h，吸棄BSA封閉液后，海馬腦切片中加入GFAP、DCX一抗工作液，基底前腦部位切片加入ChAT一抗工作液，4℃孵育過夜（約14 h），次日取出，用PBS徹底洗凈抗體后，加入相對應熒光二抗工作液，室溫孵育1.5 h，避光處理，PBS洗3次（10 min／次）后將腦片平鋪在載玻片上，滴加抗熒光衰減封片劑［含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）］，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6.2 實時熒光定量PCR法檢測基底前腦ChAT和LIM同源盒基因8 mRNA表達 采用Trizol法提取腦組織RNA，并采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，Q-PCR）測各組基底前腦ChAT和LIM同源盒基因8(LIM homeobox8,Lhx8)mRNA濃度。

1.6.2.1 RNA逆轉錄為cDNA①反應體系如下：5×Prime Script Buffer 4 μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dT Prime 1 μL，Random 6 mers 1 μL、RNA 1 μg，RNase Free H2O up to 20 μL。②反轉錄條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃10 min，完成后置于-80℃保存。

1.6.2.2 實時熒光定量PCR①反應體系如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，共20 μL。②采用ABI7500儀器進行檢測。按以下步驟進行擴增：預變性95℃30 s；95℃5 s、60℃34 s，共40個循環；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。以β-actin為內參基因，使用比較閾值法分析目的基因ChAT和Lhx8相對表達量。相對表達量（Relative quantity，RQ）的計算公式為：RQ值＝2-△△CT，△△CT＝（CT實驗組目的基因－CT實驗組內參基因）－（CT對照組目的基因－CT對照組內參基因）。

1.6.3 Western blot法檢測基底前腦ChAT蛋白表達 取出置于-80℃保存的基底前腦組織（含有蛋白裂解液），冰上溶解后提取總蛋白并檢測濃度，將各組蛋白樣品調成相同的濃度。蛋白經高溫變性后檢測各組蛋白含量。①聚丙烯酰胺凝膠電泳：按照配方配制10%分離膠和5%濃縮膠，各組取等量蛋白樣品加入電泳槽中濃縮膠樣本孔內，80 V電泳120 min。②轉膜：將蛋白轉印于聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，276 mA恒流，轉膜100 min。③免疫反應：5%脫脂奶粉封閉1～2 h，TBST緩沖液洗膜后加入ChAT抗體工作液，4℃孵育過夜，次日取出洗凈一抗后加入相應的二抗，室溫孵育1 h，洗凈殘留抗體，加入顯影劑后放入GeneGnome成像分析系統檢測蛋白條帶。

1.6.4 硫磺素T染色檢測海馬及皮層淀粉樣斑塊數量 從組織凍存液中挑出海馬及皮層部位腦片，PBS溶液中清洗3次，5 min／次，將腦片平整黏附于玻片上，待干燥后，蘇木素染色5～10 min，自來水沖洗3次，5 min／次；1%硫磺素T染色5～10 min，自來水沖洗15 min；80%乙醇分色數秒，陰干避光封片。熒光顯微鏡在DAPI激發光下檢測各組海馬及皮層Aβ斑塊的數量。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布，數據采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊用校正t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 移植的EGFP陽性NSC在體內的存活、遷移及分化情況

移植4周后，NSC移植組和聯合移植組免疫熒光下均可見移植NSC存活，并向廣泛的腦區遷移，包括胼胝體遠端、皮層以及海馬深部。聯合移植組存活細胞更多，且NSC顯示了粗大的突起。見圖1。在海馬齒狀回中，聯合移植組的NSC有更多類似于成熟顆粒細胞形態的細胞，2組移植的NSC均可表達陽性GFAP和陽性DCX。見圖2。移植4周后，NSC移植組和聯合移植組GFAP陽性細胞分化率、DCX陽性細胞分化率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2組膠質細胞及神經元分化率比較（±s）%Table 1 Differentiation rates of glial cells and neurons between two groups（±s）%

表1 2組膠質細胞及神經元分化率比較（±s）%Table 1 Differentiation rates of glial cells and neurons between two groups（±s）%

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圖1 2組移植神經干細胞的存活與遷移（×100）Figure 1 Survival and migration of neural stem cells in vivo between two groups（×100）

圖2 2組移植神經干細胞分化（×200）Figure 2 Differentiation of neural stem cells in vivo between two groups（×200）

2.2 NSC聯合NGF納米粒移植治療對APP／PS1轉基因鼠基底前腦膽堿能神經元的影響

2.2.1 ChAT神經元細胞數量 結果顯示，NSC移植組及聯合移植組基底前腦區均未見到EGFP陽性NSC。與AD對照組比較，NSC移植組及聯合移植組移植4周后，ChAT神經元細胞數量明顯增多，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與WT對照組比較，NSC移植組ChAT神經元細胞數量雖有所增加但仍明顯較低，差異具有統計學意義（P＜0.05），而聯合移植組ChAT神經元細胞數量則無明顯區別，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3、表2。

圖3 4組基底前腦膽堿能神經元數量（×200）Figure 3 The number of cholinergic neurons in the basal forebrain in four groups（×200）

表2 4組基底前腦ChAT陽性神經元數量比較Table 2 Comparison of the number of ChAT neurons in basal forebrain in four groups

2.2.2 ChAT蛋白水平表達 結果顯示，與AD對照組比較，NSC移植組及聯合移植組基底前腦ChAT蛋白水平明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與WT對照組比較，NSC移植組與聯合移植組基底前腦ChAT蛋白水平明顯降低，而NSC移植組與聯合移植組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

2.2.3 ChAT基因及其轉錄因子Lhx8基因表達 結果顯示，與AD對照組比較，NSC移植組及聯合移植組ChAT和Lhx8基因表達明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。與WT對照組比較，NSC移植組ChAT和Lhx8基因表達雖有所增加但仍明顯低于WT對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與NSC移植組比較，聯合移植組ChAT和Lhx8基因表達明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 基底前腦ChAT蛋白及ChAT、Lhx8基因表達Figure 4 Expression of ChAT protein and the gene level of ChAT／Lhx8 in the basal forebrain

2.3 NSC聯合NGF納米粒移植對APP／PS1轉基因鼠海馬及皮層Aβ斑塊的影響

采用硫磺素T染色檢測海馬及皮層Aβ斑塊數量的變化，結果顯示，WT對照組小鼠腦內無Aβ斑塊沉積，而AD轉基因鼠海馬及皮層有大量Aβ斑塊沉積。與AD對照組比較，NSC移植組、聯合移植組皮層及海馬Aβ斑塊數量雖有所減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。與NSC移植組比較，聯合移植組皮層及海馬Aβ斑塊數量無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 4組海馬及皮層Aβ斑塊數量比較（±s）Table 3 Number of Aβ plaques in hippocampus and cortex in four groups（±s）

表3 4組海馬及皮層Aβ斑塊數量比較（±s）Table 3 Number of Aβ plaques in hippocampus and cortex in four groups（±s）

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圖5 海馬及皮層Aβ斑塊染色數量比較（×100）Figure 5 Number of Aβ plaques in the hippocampus and cortex（×100）

3 討 論

研究顯示，AD中存在廣泛的膽堿能功能的退化和神經營養因子缺乏［6］，甚至早在Aβ沉積之前就可能存在膽堿能功能障礙。NGF在神經元存活、分化、成熟以及突觸生長中起重要作用［7-8］，且對基底前腦膽堿能神經元表型的維持起著不可替代的作用［9］。基底前腦作為腦內最大的膽堿能神經元核團，主要投射區包括海馬、皮層、杏仁核和嗅球。本研究采用NSC聯合NGF納米粒移植干預APP／PS1轉基因AD小鼠，觀察移植NSC存活、遷移及分化情況，以及聯合移植對基底前腦膽堿能神經元及Aβ斑塊的影響，探討NSC聯合NGF納米粒海馬移植是否對基底前腦膽堿能神經元起到直接替代或間接保護作用。

3.1 NSC聯合NGF納米粒移植可促進NSC存活及遷移

本研究結果顯示，與NSC移植組比較，聯合移植組NSC存活數量明顯增加，且NSC具有復雜突起形態。這提示聯合移植組可能通過NGF納米粒緩慢釋放NGF，發揮對NSC的保護作用以及促進NSC突起生長。這與本課題組前期研究發現，NSC聯合NGF納米粒移植可能通過緩慢釋放NGF，提高突觸前蛋白（SYP）蛋白水平，進而改善AD鼠學習記憶功能的結果一致［5］。其可能的機制是NGF可被突觸末端攝取，經逆行轉運至胞體，與其功能性受體TrKA結合，促進NSC分化及成熟，促進海馬突觸重建［10］。此外，本研究采用GFAP、DCX分別對膠質細胞及早期神經元進行標記，結果顯示NSC移植組和聯合移植組的分化率差異無統計學意義，但聯合移植組中NSC有粗大突起及形態改變。這提示，使移植的細胞分化成目標神經元，然后投射到適當的區域，與機體建立功能聯系是相當困難的，這與MARSH等［11］認為“神經替代作用要比預期復雜”的觀點相似。因此，本課題組認為NGF誘導移植NSC在腦內定向分化具有挑戰性，NSC移植促進AD小鼠認知功能恢復的作用機制可能與神經替代作用無關。

3.2 NSC聯合NGF納米粒移植增強基底前腦膽堿能功能

有研究顯示，AD中基底前腦膽堿能神經元處于受損及萎縮狀態［11］，NGF對膽堿能神經元表型的維持不可缺少，而AD中存在嚴重的神經營養因子缺乏。本研究結果顯示，NSC移植組及聯合移植組基底前腦區并無EGFP標記的NSC，與AD對照組比較，NSC移植組及聯合移植組ChAT陽性細胞數明顯增加，且ChAT蛋白相對表達量也明顯增加。這提示，NSC海馬移植可以間接補充基底前腦膽堿能神經元。NSC移植可能通過釋放神經營養因子保護基底前腦膽堿能神經元，NSC釋放的營養因子經逆行轉運，營養神經元胞體，間接修復受損的神經元，并非細胞的直接替代作用，這與BLURTON-JONES等［12］觀點相似。NSC聯合NGF納米粒移植可能通過緩慢釋放NGF，NGF既可保護移植的NSC又可被轉運營養神經元胞體。此外，NSC移植組及聯合移植組中ChAT及其轉錄因子Lhx8基因表達均明顯增加，與NSC移植組比較，聯合移植組增加明顯更多。這提示，NSC聯合NGF納米粒移植可促進ChAT及Lhx8基因的表達，LIM同源域家族Lhx8基因可作為NGF誘導膽堿能表型維持的調節器，這種調節與ERK信號通路有關［11，13］。這提示了NGF納米粒可能通過緩釋NGF，調控Lhx8基因促進ChAT表達，從而保護基底前腦膽堿能神經元。

3.3 NSC聯合NGF納米粒移植不能減輕AD腦內Aβ斑塊沉積

Aβ級聯假說作為AD經典病理假說之一，該假說認為Aβ具有神經毒性，可引起神經纖維纏結、血管損傷、神經元丟失等一系列病理改變［14］。APP／PS1轉基因小鼠是常用的AD動物模型，該雙轉基因小鼠能夠較好地模擬AD的病理和行為學特征，如Aβ斑塊沉積及認知能力下降［15-16］。本研究中采用硫磺素染色檢測移植4周后各組小鼠海馬和皮層Aβ斑塊負荷，結果顯示，12月齡APP／PS1轉基因AD小鼠海馬和皮層存在大量的Aβ斑塊沉積，而NSC移植及聯合NGF納米粒移植均不能有效減輕Aβ斑塊 沉 積。這 與ZHANG等［17］研 究 認 為 小 鼠 來 源 的NSC移植并不能改善APP／PS1轉基因小鼠Aβ斑塊沉積的結果相似。但也有部分研究認為，使用人來源NSC和人來源的間充質干細胞移植治療AD模型鼠可以顯著減少AD腦內的Aβ斑塊沉積［18］，這可能與高級物種來源的干細胞可對低級物種發揮更大的治療作用有關。本研究尚不能證實NSC移植促進AD小鼠認知功能改善與降低Aβ斑塊沉積有關。

4 小 結

NSC聯合NGF納米粒移植可以間接保護基底前腦膽堿能神經元，保護NSC的存活和成熟，并促進基底前腦ChAT和Lhx8的基因表達，但其不能減少海馬和皮層中Aβ斑塊沉積。但NSC聯合NGF納米粒移植保護基底前腦膽堿能神經元的具體機制、移植NSC分化的進一步調控及其參與宿主細胞的功能整合等尚需進一步研究。