高效液相色譜法用于測定更年安片中嘔吐毒素含量的探討

李 鑫，何 苗（通訊作者）

（淮安市食品藥品檢驗所快檢室 江蘇 淮安 223300）

更年安片，由麥冬、地黃、澤瀉、茯苓、熟地黃、玄參、仙茅、磁石、首烏藤、牡丹皮、珍珠母、五味子、何首烏、鉤藤、浮小麥等十五味中藥制成，具有除煩安神，滋陰清熱功效，主要用于女性更年期出現的失眠，眩暈，耳鳴，煩躁不安等癥狀。在其制備過程中，浮小麥等三味藥材經粉碎成細粉，直接與經提取、分離后的其余十二味藥材濃縮液混勻，制粒，干燥，過篩，壓制成片[1]。浮小麥取自禾本科小麥屬植物小麥干燥輕浮癟瘦的果實，具有益氣止汗的功效。浮小麥生長的過程中，容易受到禾谷鐮刀菌等真菌侵染，在溫濕度、日照等外在因素的影響下迅速繁殖，產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）。DON是一類單端孢霉烯族化合物，屬于天然產物，最初是從感染赤霉病的麥子中發現和提取出來的，其是一種無色針狀晶體，易溶于水和極性溶劑，化學性能比較穩定，有一定的耐酸性和耐熱性，具有神經毒性、細胞毒性、免疫毒性、致癌、致畸、致突變等危害，同時DON 對消化系統有較大影響，會引發動物嘔吐等癥狀，也被稱為嘔吐毒素[2-3]。嘔吐毒素作為浮小麥及其制劑中可能存在的污染物，一旦被人體攝入蓄積，易造成中毒，危害人體健康。因此，浮小麥以細粉的形式直接入藥制備更年安片，自身所含有的嘔吐毒素可能被帶入更年安片中[4-5]。

在現行更年安片質量標準中，包含對五味子、五味子甲素、何首烏、大黃素、大黃素甲醚、麥冬按照薄層色譜法進行鑒別，對大黃素按照高效液相色譜法進行含量測定，其他按照制劑通則進行檢查。質量控制標準中，缺乏對嘔吐毒素的限量檢查，存在一定的質量安全隱患。對嘔吐毒素的含量測定，目前主要是利用免疫親和柱法[6-7]、酶聯免疫法[8-9]等。通過建立了一種操作簡單、重復性好的方法，測定制劑中可能存在的嘔吐毒素含量，填補更年安片質量控制空白，確保用藥安全。

1.儀器與材料

1.1 儀器

戴安UltiMate3000 超高效液相色譜儀（賽默飛世爾公司）；XP-6 型電子分析天平（METTLER TOLEDO 公司）；KQ5200DE 超聲儀（昆山市超聲儀器公司）；XIR 高速低溫離心機（Thermo Fisher 公司）；FD53 烘箱（BINDER公司）。

1.2 材料

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱（20160501，AIDIVC 公司）；嘔吐毒素標準品（上海安譜，281751，200 μg/mL）；PEG（天津科盟）、鹽酸和乙醇（南化試劑）均為分析純；甲醇和乙腈（默克試劑）均為色譜純；更年安片樣品（薄膜衣片0.31 g:A 和B、糖衣片0.3 g：C 和D）。

2.方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18 柱，250 mm×4.60 mm，5 μm；流動相：甲醇-水（20 ∶80）；檢測波長：218 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.2 標準品溶液的制備

精密量取標準品1 mL 于25 mL 量瓶，用20%甲醇稀釋定容，制得標準儲備液。取上述溶液適量，加入20%甲醇稀釋，分別制成0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.2 μg/mL、1.6 μg/mL、2.0 μg/mL 的標準品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 提取 取更年安片樣品40 片，除去包衣后稱重，研細，稱取樣品細粉5 g 于100 mL 容量瓶，加入5 g PEG 和適量20%甲醇，經過30 min 超聲、冷卻后，20%甲醇定容。搖勻后，取溶液適量，經10 min 離心（4 500轉/min）后，移取上清液，過濾備用。

2.3.2 凈化 取續濾液2 mL，注入免疫親和柱，調節流速為1 滴/s。當空氣充滿親和柱后，再分別用緩沖液（稱取1.2 g 磷酸氫二鈉、8.0 g 氯化鈉、氯化鉀和磷酸二氫鉀各0.2 g，用適量水溶解稀釋，并用濃鹽酸調節溶液pH 至7.0，加水至1 L）和水各5 mL 洗脫，調節為2 滴/s 的流速，棄去溶液，直至抽干親和柱。

2.3.3 洗脫 用2 mL 甲醇洗脫親和柱，并收集溶液，氮吹洗脫液，用1 mL 20%甲醇溶解殘留物，混勻，過濾，制得。

3.結果

3.1 標準曲線及色譜圖

精密量取嘔吐毒素標準品溶液、更年安片樣品溶液各20 μL，在上述色譜條件下，注入色譜儀測定。嘔吐毒素標準品溶液和更年安片A 樣品溶液（即按照2.3 供試品溶液的制備）色譜圖分別見圖1、圖2。以嘔吐毒素標準品溶液質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，得出線性回歸方程為：Y=0.5953X-0.0011，r=0.9997（n=5），表明在0.4 ～2.0 μg/mL 嘔吐毒素線性良好。

圖1 嘔吐毒素標準品溶液（0.8 μg/mL）

圖2 更年安片A 樣品

3.2 檢出限

取標準品系列溶液，分別進樣。以信噪比3:1、10:1為檢出限和定量限，分別為1.5 ng、4 ng。

3.3 精密度

標準品溶液（1.2 μg/mL）連續進樣6 次。RSD 為1.8%，精密度良好。

3.4 加樣回收

精密稱取更年安片A（嘔吐毒素檢測陰性）樣品5 g共6 份，分別加入標準品溶液（50 μg/mL）各1 mL，照2.3 項下方法操作，測定，見表1。

表1 回收率試驗結果

3.5 穩定性

24 h內取3.4中同一加標溶液，每4 h進樣。結果顯示，RSD 為1.9%，嘔吐毒素穩定。

3.6 樣品測定

取更年安片樣品（薄膜衣片0.31 g:A 和B、糖衣片0.3 g：C 和D），依照2.3 項下處理、測定。結果顯示，均未檢出嘔吐毒素。

4.討論

本文由于篇幅有限，未對方法優化，專屬性等詳細描述。實驗中，采用空白對照，就專屬性開展研究，其中高溫破壞實驗采用80℃烘箱和80℃水浴2 種方式，氧化破壞實驗采用20%過氧化氫進行，酸堿破壞分別采用1 mol/L 鹽酸溶液和1 mol/L 氫氧化鈉進行，光照破壞采用4500LX 下照射進行破壞試驗，結果顯示方法專屬性良好。實驗中，在提取溶劑上選擇了純水、純甲醇、系列濃度甲醇-水進行實驗，采用振蕩，超聲，磁力攪拌等方式提取，通過考察不同提取溶劑和提取方式對嘔吐毒素回收率的影響，從而確定最佳提取溶劑和提取方式，后期實驗將對方法優化和專屬性開展更多研究。

更年安片樣品經超聲提取、免疫親和柱凈化洗脫后，通過HPLC 測定嘔吐毒素含量的檢測方法，其檢出限和定量限分別為1.5 ng、4 ng；平均加標回收率87.4%～96.6%，在0.4 ～2.0 μg/mL 內線性關系良好，方法操作簡單、重復性好，對更年安片中可能存在的嘔吐毒素含量進行測定，填補了其質量控制相關研究空白。