黃百香果花粉離體培養基篩選及貯藏試驗

劉潔云，吳艷艷，牟海飛，溫 放，田青蘭，韋毅剛，張英俊，符龍飛，彭嘉宇，黃偉華*

(1.廣西農業科學院生物技術研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006；3.廣西農業科學院農業資源與環境研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】百香果學名西番蓮(Passifloraedulis)，為西番蓮科西番蓮屬多年生常綠藤本植物[1]，在我國種植已有20多年歷史，主要分布于廣西、廣東、云南、貴州、福建和臺灣等省(區)。由于百香果可當年種植當年采收，生長周期短，產量高，營養豐富，經濟效益好，種植百香果已成為廣西、海南和貴州等地貧困村脫貧致富的好項目。百香果分為紫果種、黃果種和雜交種三大類[2]，其中黃果種百香果主要包括小果型黃果(小黃金)、大果型黃果(大黃金)和原生黃果。大果型黃百香果單果重200～500 g，果形較大且產量、果實出汁率均較高，適于加工和鮮食。但是，大果型黃百香果自然授粉結實率低，需進行人工授粉提高座果率，而授粉后花粉管能否萌發對能否完成受精起著決定性作用[3]。因此，分析不同配方培養基及貯藏條件對大果型黃百香果花粉離體萌發效果的影響，對大果型黃百香果的花粉活力鑒定、人工輔助授粉及雜交育種具有重要意義。【前人研究進展】花粉活力是影響大果型黃百香果授粉受精的關鍵因素之一，不同貯藏條件直接影響人工授粉的成功率[4]。已有研究表明，多數植物的花粉在低溫低濕條件下能貯藏較長時間且保持活力[5-7]。花粉活力檢測方法不同其檢測結果存在一定差異。張藝萍等[8]研究發現，離體萌發法的測定結果較染色法更能反映不同百合品種的花粉活力。任少華等[9]研究認為，TTC染色法測定的香榧花粉萌發情況與離體培養法基本一致。Oliveira等[10]以染色法分析有機栽培條件下黃果西番蓮的花粉活力，發現其具有活力的花粉比率達99.8%。Soares等[11]利用花粉離體培養和組織化學分析兩種方法分析5份百香果屬植物的花粉活力，結果顯示組織化學分析法檢測的花粉活力高于離體培養法。吳斌等[12]研究表明，適宜小黃金百香果花粉培養的蔗糖濃度為20%，硼酸濃度為0.06%，固體和液體培養基對其花粉萌發率影響較小。蔡昭艷等[13]以臺農一號百香果花粉為材料開展離體萌發試驗，結果發現蔗糖濃度、硼酸濃度、聚二乙醇(PEG-4000)、pH和培養時間對其花粉萌發均具有顯著影響。【本研究切入點】目前，有關百香果花粉活力測定的研究較少，針對不同配方培養基及貯藏條件對大果型黃百香果花粉離體培養效果影響的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】以大果型黃百香果花粉為試驗材料，采用L25(54)正交試驗設計，探究適宜大果型黃百香果花粉離體培養的蔗糖、硼酸和硝酸鈣濃度及pH，分析花朵采樣時間、貯藏濕度和溫度對花粉活力的影響，篩選適宜大果型黃百香果花粉離體培養的培養基配方并開展花粉離體貯藏試驗，為百香果花粉活力鑒定、人工輔助授粉及雜交育種等提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為本課題組選育的大果型黃百香果優異品系‘黃優6號’(暫定名)，種植于廣西農業科學院院本部基地(東經108°14′57.70″，北緯22°51′02.75")。于2020年10月選天氣晴朗時將整朵花摘下迅速帶回實驗室，用藥勺將花粉輕輕刮至硫磺紙上備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉離體培養基篩選 取花瓣剛好完全展開大果型黃百香果花朵的花粉，采用液體培養法，通過L25(54)正交試驗設計(4因素5水平)共25個處理組合(表1)篩選適宜的花粉離體培養基配方。每處理組合設3個重復。用膠頭滴管將配制好的培養基滴于雙凹載玻片，用藥勺蘸取少量花粉置于培養基中，輕微攪拌使其散布均勻，蓋上蓋玻片后放入培養皿中，于26 ℃下暗培養3 h后在顯微鏡下觀察花粉萌發情況。每處理隨機選取3個不重復的視野，每個視野花粉不少于30粒，以花粉管長度大于花粉粒直徑判定為萌發的花粉，統計花粉總數和萌發花粉數，計算花粉萌發率，篩選最佳培養基配方。花粉萌發率(%)=花粉萌發數/花粉總數×100。

表1 百香果花粉離體培養基篩選的L25(54)正交試驗設計

1.2.2 不同采集時間花朵的花粉萌發情況 經觀察，在一天中大果型黃百香果植株的開花時間集中在12:30—14:30。本研究分別在8:30、9:30、10:30、11:30、12:30、13:30、14:30、15:30、16:30、17:30和18:30采集花粉。其中，在8:30—12:30采集未開放花朵的花粉，在13:30采集花瓣剛好完全展開花朵(以13:30為花朵開放時間)的花粉，14:30—18:30采集在13:30開花后進行套袋處理花朵的花粉，使用1.2.1中篩選的最佳培養基配方進行培養，試驗操作、培養條件及統計方法同1.2.1。

1.2.3 不同貯藏條件下花粉的萌發情況 取花瓣剛好完全展開大果型黃百香果花朵的花粉，分別在不同濕度和溫度條件下貯藏0、1、2、3、4、5、6、7、24和48 h，開展花粉活力試驗。貯藏濕度設密封于離心管中常溫貯藏、平鋪在硫磺紙上自然風干和平鋪在硫磺紙上置于干燥器中貯藏3個處理，分別編號A1、A2和A3；貯藏溫度設密封于離心管中4 ℃貯藏、自然風干5 h后密封于離心管中4 ℃貯藏、密封于離心管中-20 ℃貯藏和自然風干5 h后密封于離心管中-20 ℃貯藏4個處理，分別編號B1、B2、B3和B4。使用1.2.1中篩選的最佳培養基配方進行培養，試驗操作、培養條件及統計方法同1.2.1。

1.3 統計分析

采用Excel 2007進行數據處理和圖表制作，以SPSS 19.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對大果型黃百香果花粉離體萌發的影響

由表2可知，不同培養基處理組合對大果型黃百香果花粉離體萌發率具有較大影響。其中，各因素的極值(R)排序為C(45.06)>A(34.62)>B(17.49)>D(16.53)，說明4個因素對花粉萌發率影響的排序為硝酸鈣>蔗糖>硼酸>pH；根據不同因素的均值(K)可知，最佳培養基處理組合為A3B2C3D1，但該處理組合未出現在正交設計表中；表2中處理組合A3B2C4D1的平均花粉萌發率最高，為81.30%。由表3的方差分析結果可知，C因素對大果型黃百香果花粉萌發率的影響達極顯著水平(P<0.01)，A因素的影響達顯著水平(P<0.05，下同)，B因素和D因素對花粉萌發率的影響未達顯著水平(P>0.05，下同)。以處理組合A3B2C3D1進行大果型黃百香果花粉離體培養，結果(圖1)發現其萌發率達85.55%。可見，100.00 g/L蔗糖+0.02 g/L硼酸+0.40 g/L硝酸鈣，pH 5.0，為大果型黃百香果花粉離體萌發的最適培養基。

表2 不同培養基對大果型黃百香果花粉離體萌發的影響

表3 大果型黃百香果花粉離體萌發率的方差分析結果

2.2 大果型黃百香果花朵不同采樣時間對其離體花粉活力的影響

從圖2可看出，一天內大果型黃百香果不同采樣時間花朵的花粉萌發率呈先升高后降低的變化趨勢。其中，開花時(13:30)采集花朵的花粉萌發率高于開花前采集花朵的花粉萌發率；在開花前采集花朵時間越早，其萌發率越低，尤其8:30采集花朵的花粉萌發率僅67.78%，顯著低于其他采樣時間，即此時采集的花粉活力最弱；開花后采集花朵的花粉萌發率總體上呈先升高后降低的變化趨勢，以16:30采集的花粉萌發率最高，為89.79%，但與13:30和15:30采集的花粉萌發率差異不顯著；在18:30采集花朵的花粉萌發率仍較高，為78.56%，即此時采集花粉的活力仍較強；11:30—17:30采集花朵的花粉萌發率均在80.00%以上。可見，在11:30—17:30采集的大果型黃百香果花朵其花粉活力均較強，其中開花后3 h(16:30)的花粉活力最強。

2.3 不同貯藏濕度對大果型黃百香果離體花粉活力的影響

從圖3可看出，A1和A2處理大果型黃百香果花粉的萌發率隨著離體貯藏時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢，A3處理的花粉萌發率隨著離體貯藏時間的延長呈降低趨勢。其中，A1處理離體貯藏1 h花粉的萌發率最高，為87.36%，之后隨著離體貯藏時間的延長，花粉萌發率持續降低，至處理24 h時為38.95%，至處理48 h時為15.73%；A2處理的離體貯藏花粉萌發率下降較另2個處理緩慢，在處理3～48 h時均顯著高于A1和A3處理，在處理5 h時仍達80.76%，處理24 h時為48.76%，處理48 h時為34.28%；A3處理的離體貯藏花粉萌發率下降最明顯，在處理1～48 h時均顯著低于另2個處理，處理7 h時為2.55%，處理24和48 h時均為0。可見，大果型黃百香果花粉平鋪在硫磺紙上自然風干貯藏，其活力強于密封于離心管中常溫貯藏和平鋪在硫磺紙上置于干燥器中貯藏。

2.4 不同貯藏溫度對大果型黃百香果離體花粉活力的影響

從圖4可看出，B1處理1～3 h大果型黃百香果離體貯藏花粉的萌發率均明顯高于同時間段B2處理的花粉，之后B2處理花粉的萌發率高于B1處理；B2處理24 h時的花粉萌發率為61.49%，處理48 h時的花粉萌發率仍達55.22%，均顯著高于同時間段其他溫度處理；B3處理的花粉萌發率下降明顯，處理1～48 h時均顯著低于同時間段其他溫度處理，其中在處理3 h時的萌發率僅為26.76%，處理7、24和48 h時萌發率均為0；B4處理的花粉萌發率下降趨勢較B3處理平緩，處理7 h時為43.83%，處理48 h時為5.41%。可見，大果型黃百香果花粉在4 ℃下的貯藏效果優于在-20 ℃下貯藏，而自然風干5 h后密封于離心管中4 ℃貯藏的花粉活力最強。

3 討 論

花粉離體萌發過程中受多種因素影響，其中培養基配方的影響較大。蔗糖是花粉離體培養基的主要成分，不僅為花粉萌發提供營養，還發揮調節滲透勢的作用[14]。硼是植物有性生殖過程中必需的微量元素，在培養基中添加硼酸有利于花粉萌發及花粉管伸長[15]。鈣是花粉生長所需的物質成分，杜兵帥等[16]研究表明，鈣離子對調控花粉管極性生長具有重要作用，且是影響花粉管萌發和生長的重要因素。花粉能在一定的pH范圍內萌發，王玉林等[17]研究發現，培養基的pH在6.5～7.5時，火龍果花粉離體萌發率較高。本研究結果與上述研究結果相似，其中，硝酸鈣對大果型黃百香果花粉離體萌發的影響達極顯著水平，當硝酸鈣濃度為0時，花粉萌發率較低或不萌發；蔗糖對大果型黃百香果花粉萌發的影響達顯著水平，蔗糖濃度為100.00 g/L時花粉萌發率最高，蔗糖濃度過低或過高均影響花粉萌發；硼酸和pH對大果型黃百香果花粉離體萌發影響較小。吳斌等[12]研究認為蔗糖和硼酸濃度對小黃金百香果的花粉萌發具有顯著影響，蔡昭艷等[13]研究表明pH、蔗糖和硼酸對“臺農一號”百香果花粉萌發均具有影響顯著，本研究結果與吳斌等[12]的研究結果存在差異，可能與培養基組分對不同百香果品種花粉萌發的影響不同有關。

植物雜交育種過程中常出現親本花期不遇或需要異地雜交等情況，因此研究花粉的貯藏條件以保持花粉活力至關重要。花粉的貯藏力受自身遺傳特性和外界因素影響，外界因素中溫度和濕度對花粉活力的影響均較大[18]。潘磊等[19]研究發現，低溫有利于煙草花粉形態和活力保持。本研究中，大果型黃百香果開花前一定時間內的花粉活力與開花時相近，開花后3 h的花粉活力有所提升，之后顯著下降，說明大果型黃百香果開花前后一定時間內的花粉均具有較強活力，可用于人工授粉。本研究探討了密封于離心管、自然風干和置于干燥器中的3種濕度條件及4 ℃和-20 ℃溫度條件下的4種貯藏方法對百香果花粉離體萌發的影響，結果表明自然風干5 h后密封于離心管中4 ℃貯藏效果最佳，貯藏48 h時花粉的萌發率仍達55.22%，說明貯藏濕度和溫度對大果型黃百香果花粉的活力均具有明顯影響。其中，平鋪在硫磺紙上置于干燥器中貯藏及密封于離心管中-20 ℃貯藏的花粉活力下降較快，可能與干燥器貯藏濕度過低，花粉中的水分蒸發過快，以及在濕度較大情況下置于-20 ℃貯藏花粉中的水分容易產生結晶，從而導致花粉失活有關。本研究中設置的花粉貯藏時間最長為48 h，下一步可通過超低溫保存技術進一步探究如何延長百香果花粉的貯藏時間。

4 結 論

100.00 g/L蔗糖+0.02 g/L硼酸+0.40 g/L硝酸鈣及pH 5.0為大果型黃百香果花粉離體萌發的最適培養基。當天采集大果型黃百香果花朵的花粉自然風干5 h后密封于離心管4 ℃貯藏其萌發效果最佳。