環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測呼吸道病毒方法的建立及應(yīng)用

池細(xì)俤，高世華，張忠源，葉桂云

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院 檢驗科，福建 南平353000)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)是近年興起并逐步應(yīng)用于臨床的一種新穎的核酸檢測技術(shù)，它已被成功應(yīng)用于各種病原體[1]、寄生蟲[2]、腫瘤基因[3]、農(nóng)業(yè)水產(chǎn)等領(lǐng)域的快速檢測。本文通過建立乙型流感病毒(FluB)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)的LAMP檢測方法，并比較分析LAMP技術(shù)與直接免疫熒光技術(shù)(DFA)在檢測急性呼吸道感染(ARTI)病毒時的診斷結(jié)果的一致性，以探索LAMP技術(shù)在ARTI病毒實驗室診斷的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2019年3月-12月期間，收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院門診及住院具ARTI癥狀的患者鼻咽拭子共74份，患者：男性40例、女性34例；年齡1月-20歲。鼻咽拭子置-20℃冰箱保存。

1.2 儀器與試劑

1.2.1儀器 BX 53熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)；恒溫擴(kuò)增儀(上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司)。

1.2.2試劑 鼻咽拭子(Copan Flock Technologies S.R.L公司)；呼吸道病毒DFA檢測試劑(Diagnostic Hybrids.INC公司)；LAMP相關(guān)試劑：LAMP引物(上海百力格生物技術(shù)有限公司)；INNOGENX多引物恒溫擴(kuò)增緩沖液(上海創(chuàng)稷醫(yī)療科技有限公司)；dNTPs(上海宏誼生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶(上海創(chuàng)稷醫(yī)療科技有限公司)；Bst酶(上海創(chuàng)稷醫(yī)療科技有限公司)；陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品(上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)；核酸提取及純化試劑(上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)。

LAMP引物設(shè)計：在Genebank上檢索A、B、C型腺病毒；A、B亞型呼吸道合胞病毒；V、Y系乙型流感病毒的堿基序列，用MEGA5進(jìn)行序列比對分析，分別獲得不同病毒特異性保守序列，利用在線引物設(shè)計軟件Primer Explorer V5，設(shè)計了LAMP反應(yīng)所需的引物(包括內(nèi)引物、外引物和環(huán)狀引物各2個，每個病毒共6個引物)，見表1。

表1 LAMP引物組序列

1.3 方法對74份鼻咽拭子樣本分別進(jìn)行DFA抗原檢測和LAMP核酸檢測。

1.3.1樣本采集 將鼻咽拭子緩緩插入患者鼻咽管，至鼻咽部，旋轉(zhuǎn)3-5周后，取出拭子放入裝有無菌生理鹽水的采集管中送檢，不能及時送檢者需放4℃冰箱但不宜超過24 h。

1.3.2DFA抗原檢測 細(xì)胞片制備、DFA抗原檢測、結(jié)果判斷等操作嚴(yán)格按Diagnostic Hybrids.INC公司試劑盒說明書。

1.3.3LAMP核酸檢測 ①核酸提取及純化：鼻咽拭子復(fù)融后進(jìn)行振蕩混勻，離心后按說明書取40 μl混懸液加入10 μl核酸提取及純化試劑，置金屬浴煮沸裂解10 min，取出冷卻離心備用，上清液即為待檢模板。②LAMP反應(yīng)體系配制：(1)引物+酶混合液：外引物3 μmol/L、內(nèi)引物10 μmol/L、環(huán)狀引物5 μmol/L、逆轉(zhuǎn)錄酶5 U/μL、Bst酶5 U/μL、UNG酶0.03 U/μL。(2)LAMP緩沖液：dNTPs 2 mmol/L、5×buffer。(3)每個反應(yīng)體系總體積20 μl：引物+酶混合液2 μl、LAMP緩沖液13 μl、模板5 μl。③恒溫擴(kuò)增儀實驗參數(shù)設(shè)置：實驗時間45 min、實驗溫度63℃、熔解曲線“√”、終止溫度64℃、溫度步增0.3℃。④結(jié)果判讀：觀察擴(kuò)增曲線并記錄起峰點(diǎn)的Tt值，當(dāng)有典型擴(kuò)增曲線且Tt值≤20 min為陽性；無擴(kuò)增曲線或Tt值>20 min為陰性。⑤質(zhì)量控制：每個檢測批次都包括陰性對照、陽性對照，質(zhì)控品出現(xiàn)假陽性或假陰性則舍去本批實驗結(jié)果，并進(jìn)行復(fù)檢。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

兩種方法檢測結(jié)果比較采用McNemar檢驗(配對χ2檢驗)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；方法學(xué)一致性檢驗采用Kappa檢驗(Kappa≥0.75兩者一致性較好；0.75>Kappa≥0.4兩者一致性一般；Kappa<0.4兩者一致性較差。)

2 結(jié)果

2.1 乙型流感病毒檢測結(jié)果比較

對74份標(biāo)本進(jìn)行乙型流感病毒感染標(biāo)志物檢測，兩種檢測方法共同測定陽性13例、共同測定陰性53例，見表2。檢測熒光擴(kuò)增曲線見圖1。結(jié)果顯示LAMP相對DFA的靈敏度(陽性符合率)為92.86%(13/14)，特異度(陰性符合率)為88.33%(53/60)，整體符合率為89.19%(66/74)；用SPSS統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，兩種檢測方法針對乙型流感病毒的診斷結(jié)果一致性一般(Kappa=0.697，P<0.001)；LAMP法檢出率為27.03%，高于DFA法(18.92%)，但經(jīng)McNemar檢驗差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.070>0.05)。

表2 乙型流感病毒LAMP和DFA的檢測結(jié)果對比(n)

圖1 乙型流感病毒LAMP檢測熒光擴(kuò)增曲線

2.2 腺病毒檢測結(jié)果比較

對74份標(biāo)本進(jìn)行腺病毒感染標(biāo)志物檢測，兩種檢測方法共同測定陽性9例、共同測定陰性54例，見表3。LAMP相對DFA的靈敏度為52.95%(9/17)，特異度為94.74%(54/57)，整體符合率為85.14%(63/74)；兩種檢測方法針對腺病毒的診斷結(jié)果一致性一般(Kappa=0.532，P<0.001)；LAMP檢出率為16.22%，低于DFA(22.97%)，但經(jīng)McNemar檢驗差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.227>0.05)。

表3 腺病毒LAMP和DFA的檢測結(jié)果對比(n)

2.3 呼吸道合胞病毒檢測結(jié)果比較

對74份標(biāo)本進(jìn)行呼吸道合胞病毒感染標(biāo)志物檢測，兩種檢測方法共同測定陽性4例、共同測定陰性68例，見表4。LAMP相對DFA的靈敏度為80.00%(4/5)，特異度為98.55%(68/69)，整體符合率為97.30%(72/74)；兩種檢測方法針對呼吸道合胞病毒的診斷結(jié)果一致性較好(Kappa=0.786，P<0.001)；LAMP檢出率與DFA相同均為6.76%，經(jīng)McNemar檢驗差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000>0.05)。

表4 呼吸道合胞病毒LAMP和DFA的檢測結(jié)果對比(n)

3 討論

研究表明ARTI 近80%由病毒引起[4-5]，至少涉及7個病毒科10多類共239個型別的病毒[6]。呼吸道病毒具有傳染性強(qiáng)，傳播速度快，潛伏期短等特點(diǎn)，且不同呼吸道病毒導(dǎo)致的臨床癥狀相似，80%患者表現(xiàn)咳嗽癥狀，50%患者有發(fā)熱癥狀[7]，由于缺乏合適的病原學(xué)診斷，臨床上對ARTI病人往往采取經(jīng)驗性治療而非針對性治療，結(jié)合今年我國成功控制COVID-19疫情的經(jīng)驗，及時準(zhǔn)確的病原體檢測不但可快速確診ARTI患者，及時向其提供針對性治療、避免濫用抗生素，而且對開展流行病學(xué)調(diào)查，控制病毒傳播途徑、對人群采用預(yù)防措施等均具有重要臨床意義，因此研究快捷和準(zhǔn)確的呼吸道病毒的檢測方法已成為臨床實驗室的重要任務(wù)。

臨床上針對呼吸道病毒病原的檢測方法目前常用的有RT-PCR、DFA、間接免疫熒光、LAMP等[8]。上述方法中，RT-PCR、DFA和間接免疫熒光的檢驗質(zhì)量易受實驗條件、檢驗人員主觀能力等影響。如RT-PCR對實驗室條件及儀器設(shè)備配置要求較高，不利于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展；間接免疫熒光可能受患者既往感染，體內(nèi)的抗體未代謝完，出現(xiàn)假陽性率偏高[9]，還可能因患者處在“窗口期”出現(xiàn)檢測結(jié)果假陰性。DFA檢測呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原，對標(biāo)本來源、取材時機(jī)、采樣質(zhì)量要求較高[10]，而且實驗步驟較多、操作較復(fù)雜，在結(jié)果判斷上存在一定主觀性，但因其具有相對較高特異性和敏感性，目前仍是很多實驗室呼吸道病毒檢測的主流方法[11]，因此本研究將其做為參考方法。LAMP技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、可根據(jù)Tt值客觀判讀結(jié)果等優(yōu)勢[8]，還具有良好的儀器通用性，可在恒溫擴(kuò)增儀也可在熒光PCR儀上進(jìn)行，臨床應(yīng)用前景較好。

LAMP 技術(shù)是Notomi等在2000年首先提出來的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其基本原理主要是根據(jù)靶基因3′和5′端的6個區(qū)域的序列設(shè)計4-6個特異性引物[12-13]，在恒定溫度條件下Bst DNA聚合酶對模板進(jìn)行快速特異性擴(kuò)增。本研究中LAMP 法檢測呼吸道病毒的原理：通過逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后在60-65℃恒定溫度下，特異性引物與cDNA模板結(jié)合，在具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增，并最終形成雙鏈DNA混合物；擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸染料結(jié)合后發(fā)出熒光信號，由儀器捕獲熒光信號，并進(jìn)行處理分析，形成擴(kuò)增曲線；根據(jù)Tt值和擴(kuò)增曲線形態(tài)判斷檢測結(jié)果。

本研究通過應(yīng)用LAMP和DFA技術(shù)對74例疑似呼吸道感染患者咽拭子樣本進(jìn)行乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒等3種呼吸道病毒的平行檢測，結(jié)果顯示LAMP相對DFA檢測的靈敏度(陽性符合率)不低于52.95%，特異度(陰性符合率)不低于88.33%，整體符合率不低于85.14%，McNemar檢驗顯示兩者檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，并經(jīng)Kappa檢驗分析兩種檢測方法針對3種呼吸道病毒的診斷結(jié)果一致性較好(Kappa值分別為0.697、0.532、0.786)。相比于傳統(tǒng)檢測方法，LAMP是針對病原體靶基因的更為高特異性、高效的快速檢測手段，在病原檢測中具有更高的靈敏度[14]。但本實驗檢測腺病毒中LAMP的檢出率略低于DFA，考慮與引物設(shè)計有關(guān)，可通過持續(xù)優(yōu)化引物序列等實驗條件予以改善。

LAMP檢測周轉(zhuǎn)時間(TAT)較短，其擴(kuò)增過程耗時一般在20 min左右，較RT-PCR(120 min左右)短，而且針對不同靶基因的LAMP可設(shè)置相同的反應(yīng)溫度和實驗參數(shù)，有利于采用基于微流控的芯片技術(shù)實現(xiàn)多通量的POCT檢測[15]。但也存在一定不足，例如目前LAMP無法提供病原體定量檢測結(jié)果，只能用于定性分析；每個恒溫擴(kuò)增檢測均需要4-6條引物，且每條引物bp值較大，引物間可發(fā)生相互干擾，一般只能在1管中檢測1種病原體，不能將多個靶基因引物簡單混合，如果需要檢測多病原體，則需要增加檢測管數(shù)[16]；LAMP擴(kuò)增的終產(chǎn)物的濃度高，容易導(dǎo)致實驗室污染，實驗中應(yīng)盡量實行閉管操作。

綜上所述，針對呼吸道病毒的病原診斷LAMP與DFA具有較高的一致性，而LAMP因具有對實驗條件要求較低、實驗步驟少、操作簡單、結(jié)果判讀客觀和TAT較短等優(yōu)點(diǎn)。