miR-204在宮頸癌中的表達及對宮頸癌細胞生物學行為的調控機制研究

任 丹，宋一村，成榮杰，吳紅梅，畢丹丹，王曉菲，李 楠*

(1.齊齊哈爾醫學院附屬第五醫院 大慶龍南醫院 病理科，黑龍江 大慶163000;2.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院 a.病理科；b.婦科，黑龍江 哈爾濱150001)

宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一，我國每年新發病例達13.15萬，其中宮頸癌死亡人數約5.3萬，嚴重危害我國女性身體健康[1-2]，宮頸癌發病的相關基因分子信號機制及新型靶向治療研究一直是該領域的熱點[3-4]。目前已認識到微小RNA(miRNA)與宮頸癌的發病密切相關，探索其作用信號調控機制有助于深入認識宮頸癌發病的分子機制[5]。以往研究報道miR-204通過介導一系列的信號通路在宮頸癌及腫瘤發生發展中發揮著重要的作用[6-7]，而miRNA的生物學功能主要通過靶向基因mRNA結合來實現，有研究發現沉默信息調節蛋白1(SIRT1)、CXC趨化因子受體4(CXCR4)參與了宮頸癌的發病過程[8-9]，miR-204可調控SIRT1在多種癌癥中發揮抑癌作用，且SIRT1具有抑制CXCR4表達活性的作用[10-11]。然而，目前尚不清楚miR-204是否通過介導SIRT1/CXCR4信號通路參與了宮頸癌的發病過程。因此，本項目擬借助臨床研究聯合體外細胞實驗通過分子生物學檢測手段，解析miR-204調控SIRT1/CXCR4信號通路在宮頸癌中的作用機制，以期深入認識宮頸癌發病的分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2017年1月在大慶龍南醫院行手術切除的宮頸癌癌組織及癌旁正常組織各30例，患者年齡范圍35-75歲，平均年齡(44.92±3.21)歲，納入標準：(1)宮頸癌的診斷標準參考人民衛生出版社《婦產科學》第8版標準；(2)所有患者均在本院接受手術治療，標本來源于CIN Ⅱ級-Ⅲ級術后患者；(3)宮頸癌患者臨床分期為Ⅰ期-Ⅱ期；(4)所有患者手術前均未接受放化療。排除標準：(1)轉移性宮頸癌；(2)合并其他部位惡性腫瘤疾病；(3)既往有放化療病史。組織樣本在手術室收集后于15 min內進行處理，組織樣本置于液氮罐，被凍存于-80℃冰箱內,本研究經醫院倫理委員會批準。人宮頸癌Hela細胞株均購于上海中科院細胞庫。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM 培養基，胰蛋白酶購自Gibco公司。胎牛血清購自Hyclone公司。MTT試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒及Western Blot試劑盒購自上海碧云天生物公司。Transwell 小室購自美國Corning 公司。SIRT1、CXCR4一抗購自Proteintech公司。TRIzol 提取試劑、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA 反轉錄試劑盒購自寶日生物技術有限公司。白藜蘆醇、EX527及 Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司。引物序列由上海生工生物公司設計合成，miR-204模擬物由上海吉瑪基因公司設計并合成。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。凝膠成像儀購自Bio-Rad公司。SDS-PAGE蛋白電泳儀及濕式電轉移系統購自北京六一儀器廠。ABI7500定量PCR儀購自Life公司。NanoDrop 2000超微量分光光度計購自美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養及轉染 人宮頸癌Hela細胞株于37 ℃，5%CO2中培養，待細胞密度達80%-90%，可用0.25%胰蛋白酶消化用于后續實驗，實驗分組，對照組：加入PBS液；miR-204過表達組：轉染構建miR-204基因過表達細胞；miR-204過表達+SIRT1激動劑白藜蘆醇組：miR-204過表達后加入20 μmol/L的白藜蘆醇預處理2 h；miR-204過表達+SIRT1拮抗劑EX527組：miR-204過表達后加入20 μmol/L的EX527預處理2 h。轉染前一天，加入無抗生素的完全培養基，用Opti-MEM稀釋miR-204模擬物，輕輕混勻，室溫靜置5 min；Opti-MEM稀釋Lipofectamine2000，輕輕混勻，室溫靜置5 min；室溫孵育20 min；轉染后繼續常規培養4-6 h后更換新的完全培養基，繼續常規培養24-96 h，進行后續處理。

1.3.2qRT-PCR 檢測mRNA的表達 TRIzol提取試劑提取組織和細胞總RNA，光度計測定總RNA濃度，測定RNA在260 nm、280 nm的吸光度值，檢測純度和計算濃度，RNA樣品A260/280在1.8-2.1為合格。通過反轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR 擴增，以GAPDH為內參，引物見表1，反應體系和反應程序見表2、表3。采用2-ΔΔCt分析mRNA相對表達量。

表3 反應程序

1.3.3Western Blot檢測細胞SIRT1、CXCR4蛋白表達 加入RIPA裂解液至冰上充分裂解，離心后取上清，BCA法測定總蛋白濃度，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后電轉，用5% TBS(含脫脂奶粉)封閉1 h，加入1∶1000稀釋的SIRT1、CXCR4和GAPDH一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗5 min×3次后加入適當濃度(1∶5000)的二抗，室溫孵育1 h。TBST漂洗5 min×3次，暗室內浸入ECL液顯色。

1.3.4MTT法檢測細胞活力 于轉染后24 h、48 h、72 h和96 h不同時間點，每孔加入 MTT溶液 20 μl，繼續常規培養4 h后終止培養，吸棄原培養基，加入150 μl DMSO，室溫下孵育10 min；隨后振蕩10 min，以空白對照孔調零，用酶標儀測定490 nm處OD值，繪制細胞的活力曲線。

1.3.5Annexin V-FIPC/PI雙染色法流式細胞儀檢測凋亡 取對數生長期的細胞以105個/ml密度培養24 h；加入5 ml不含胎牛血清的基礎培養基，1 000 rpm/min，離心5 min，PBS漂洗2次，棄上液，取細胞數105個加入100 μl 1×binding buffer，分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，冰浴反應18 min；每管再加入1×binding buffer 300 μl，用300目尼龍網過濾，用FACS Calibur型流式細胞儀檢測細胞凋亡，實驗重復3次，取平均值。

1.3.6Transwell小室細胞侵襲實驗 胰酶消化，用含BSA的無血清培養基重懸，調整細胞密度至(1-10)×105個/ml，加200 μl懸液至上室，然后加500 μl含10%胎牛血清的完全培養基至下室，培養24 h。取出小室，甲醇固定15 min，蘇木素染液染色15 min，顯微鏡下隨機選取5個高倍視野計數穿過膜的細胞數，重復3次。

1.4 統計分析

所有數據測定結果采用SPSS19.0統計軟件進行分析，計量資料均采用均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，計數資料以率表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-204、SIRT1、CXCR4在宮頸癌組織和癌旁正常組織的表達

與癌旁正常組織相比，宮頸癌組織中miR-204 mRNA相對表達量明顯下降，SIRT1和CXCR4mRNA相對表達量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1。

圖1 miR-204、SIRT1、CXCR4在宮頸癌組織和癌旁正常組織的表達

2.2 調控miR-204對宮頸癌細胞增殖的影響

MTT實驗顯示與對照組相比，miR-204過表達組細胞增殖率顯著下降(P<0.05)，miR-204過表達+白藜蘆醇組增殖率無明顯差異(P>0.05)，miR-204過表達+EX527組增殖率顯著下降，且miR-204過表達+EX527組與miR-204過表達組存在顯著性差異(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 調控miR-204對宮頸癌細胞增殖影響

2.3 調控miR-204對宮頸癌細胞侵襲的影響

Transwell小室實驗顯示與對照組相比，miR-204過表達組細胞侵襲細胞數顯著下降(P<0.05)，miR-204過表達+白藜蘆醇組無明顯差異(P>0.05)，miR-204過表達+EX527組顯著下降，且miR-204過表達+EX527組與miR-204過表達組存在顯著性差異(P<0.05)，詳見圖3。

圖3 調控miR-204對宮頸癌細胞侵襲影響

2.4 調控miR-204對宮頸癌細胞凋亡的影響

流式細胞術測定結果顯示與對照組相比，miR-204過表達組細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，miR-204過表達+白藜蘆醇組無明顯差異(P>0.05)，miR-204過表達+EX527組顯著上升(P<0.05)，且miR-204過表達+EX527組與miR-204過表達組存在顯著性差異(P<0.05)，詳見圖4、圖5。

A：對照組；B：miR-204過表達；C：miR-204過表達+白藜蘆醇組；D：miR-204過表達+EX527組

圖5 各組宮頸癌細胞凋亡的影響

2.5 調控miR-204對宮頸癌細胞SIRT1、CXCR4的影響

qPCR檢測及WB檢測結果顯示，與對照組相比，miR-204過表達組SIRT1、CXCR4顯著下降(P<0.05)，miR-204過表達+白藜蘆醇組無明顯差異(P>0.05)，miR-204過表達+EX527組顯著下降(P<0.05)，且miR-204過表達+EX527組與miR-204過表達組存在顯著性差異(P<0.05)，詳見圖6、圖7。

注：與對照組及miR-204過表達+白藜蘆醇組相比，*P<0.05，與miR-204過表達組相比，#P<0.05。

圖7 調控miR-204對宮頸癌細胞SIRT1、CXCR4 蛋白的影響

3 討論

宮頸癌是發病率最高的生殖系統惡性腫瘤，高發病率及病死率是導致宮頸癌患者不良預后的主要原因[12]。盡管近年來治療手段得到了長足發展，但由于發病機制尚未完全明確，中晚期宮頸癌患者預后并未得到明顯改善[13]。進一步深入闡明宮頸癌發病的分子機制對于提高宮頸癌診治能力具有重要意義，近年研究發現，miRNA在宮頸癌發生發展等惡性進展中發揮關鍵調控作用。

miR-204定位于人類9號染色體上73424891-73425000位置之間，屬于抑癌基因，近來研究表明miR-204參與宮頸癌的發生、發展及侵襲轉移等[14]。本研究發現與癌旁正常組織相比，miR-204在宮頸癌組織中的表達量顯著降低，與Wu等的研究[15]結果類似。據生物信息學數據分析，miR-204具有多種靶基因，SIRT1便是其中之一，但關于miR-204調控SIRT1是否參與宮頸癌細胞生物學行為目前不得而知，為了進一步探究miR-204的具體功能是否與調控SIRT1通路有關，本研究miR-204模擬物轉染至宮頸癌細胞誘導呈miR-204過表達模型，然后分別予以SIRT1激動劑白藜蘆醇和抑制劑EX57干預，觀察各自處理對細胞增殖，侵襲和凋亡的影響，結果顯示，與不處理的對照組相比，miR-204過表達組的細胞增殖和細胞侵襲能力下降，SIRT1、CXCR4 表達水平均明顯下降，同時凋亡率明顯增加，表明提高miR-204表達有助于減緩腫瘤細胞生長和轉移，而給予白藜蘆醇后，細胞增殖、細胞侵襲及凋亡能力，SIRT1和CXCR4 表達水平均未發生明顯變化，表明給予SIRT1激動劑后可以逆轉miR-204過表達引起的抗腫瘤作用，與之相反的是給予抑制劑后，miR-204過表達的抗腫瘤作用明顯增強，提示SIRT1為miR-204參與調控的下游靶基因，SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白脫乙酰酶，研究顯示抑制SIRT1可發揮抑癌作用[16]。CXCR4在多種惡性腫瘤細胞中高表達，能夠促進惡性腫瘤的發展和轉移[17]，本研究進一步證實SIRT1和CXCR4在宮頸癌中高表達，抑制其表達可以實現抑制腫瘤細胞增長。本研究表明可通過提高miR-204表達抑制SIRT1/CXCR4通路參與調控宮頸癌細胞的生物學行為。

綜上所述，miR-204在宮頸癌中呈現低表達，提高miR-204表達可以經SIRT1/CXCR4通路抑制宮頸癌細胞增殖和侵襲，并促進凋亡，miR-204 可作為一種潛在的治療靶點。