221例初篩RhD陰性個(gè)體中D變異型分析

聶婷婷，楊 帆，韓 瑜，于江虹，劉玲玲，焦立新

(吉林省血液中心，吉林 長(zhǎng)春130033)

在Rh血型系統(tǒng)抗原中，發(fā)現(xiàn)D抗原免疫原性最強(qiáng)[1]。RhD抗原不合的輸血或妊娠等可以產(chǎn)生Rh抗體并導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血病[2-3]。根據(jù)紅細(xì)胞膜上RhD抗原的數(shù)量不同以及抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生變化使RhD抗原有多種變異型，包括弱D(Weak D)、部分D(Partial D)及D放散型(Del)。由于RhD變異型血清學(xué)表達(dá)的差異不明顯，在血清學(xué)中難以準(zhǔn)確區(qū)分，一般需要結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行RHD基因鑒別[4-5]。本研究應(yīng)用熒光PCR方法與血清學(xué)共同檢測(cè)，避免可能出現(xiàn)的誤判。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2020年7月-2020年12月期間在本血液中心獻(xiàn)血的志愿者，采用單克隆抗體IgM-D試劑經(jīng)PK7300全自動(dòng)血型分析儀初篩為RhD陰性血液樣本共221例。

1.2 儀器與試劑

全自動(dòng)血型分析儀(貝克曼PK7300，美國(guó))；熒光定量PCR儀(ABI 7500，美國(guó))；人類紅細(xì)胞RHD基因分型檢測(cè)試劑盒(江蘇偉禾生物科技有限公司)；樣本釋放劑試劑盒(廣州展全生物科技有限公司)；微柱凝膠抗人球卡(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；單克隆抗體IgG抗-D試劑、單克隆抗體IgM抗-D試劑、抗人球蛋白試劑(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司)。

1.3 方法

1.3.1RhD陰性的血型血清學(xué)確認(rèn) 采用間接抗人球蛋白試驗(yàn)(IAT)進(jìn)行RhD陰性確認(rèn)并鑒定弱D型[6]。

1.3.2Del型的血型血清學(xué)檢測(cè) 上述實(shí)驗(yàn)RhD陰性樣本繼續(xù)進(jìn)行吸收放散實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照，采用0.9%生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，以2 500 r/min離心2 min，取200 μl待檢壓積紅細(xì)胞與200 μl的IgG抗-D單克隆抗體在37℃水浴箱中，溫育1 h，期間每隔20 min搖晃一次。0.9%生理鹽水洗滌紅細(xì)胞6次，留取末次上清作為對(duì)照。取壓積紅細(xì)胞200 μl與酸釋放液1∶1混合，吸管吹打3次，3 500 r/min離心3 min，吸取上清的放散液至新的試管中，加入3-5滴中和液至溶液變?yōu)樗{(lán)紫色后再次離心，3 500 r/min 3 min取上清100 μl，加入微柱凝膠卡孔中，每孔中還需加入1%的RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液50 μl，37℃孵育15 min，卡式專用離心機(jī)離心10 min，判讀結(jié)果:凝集為陽(yáng)性(Del型)。

1.3.3熒光PCR 檢測(cè)RHD基因型 提取經(jīng)吸收放散確定的Del型樣本的基因組DNA，根據(jù)偉禾生物公司提供的試劑盒如下：滅菌水12.6 μl/孔，B2主反應(yīng)液3 μl/孔，E2酶混合液0.4 μl/孔，DNA濃度要求在15-40 ng/μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃ 2 min 30 s，1個(gè)循環(huán)；94℃15 s、65℃ 55 s、共35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)終止。根據(jù)反應(yīng)曲線，結(jié)合試劑盒提供的結(jié)果判讀表確定基因型，見表1。

表1 熒光PCR結(jié)果判讀表

1.4 RHD基因變異型驗(yàn)證隨機(jī)抽取熒光PCR檢測(cè)出的RHD基因變異型6例，包括：Del 1227AA純合型3例、Del 1227GA雜合型1例、弱D15型2例，進(jìn)行RHD基因10個(gè)外顯子序列分析，驗(yàn)證熒光PCR方法檢測(cè)的正確性。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果221例初篩RhD陰性樣本經(jīng)RhD陰性確認(rèn)及Del型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RhD變異型46例，包括：弱D型12例、Del型34例，另外175例樣本為RhD陰性(見表2)。

表2 初篩RhD陰性樣本血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果(n=221)

2.2 熒光PCR方法結(jié)果46例RhD變異型樣本經(jīng)熒光PCR方法檢測(cè)到Del 1227A純合型33例，Del 1227GA雜合型1例，弱D15型G282D 12例(見表3)。

表3 46例RhD血清學(xué)變異樣本基因檢測(cè)結(jié)果

2.3 RHD基因變異型驗(yàn)證結(jié)果RHD基因10個(gè)外顯子區(qū)序列分析證實(shí)：3例Del 1227AA型個(gè)體堿基序列在1227位是A和A的純合子，1例Del 1227GA型個(gè)體在1227位是A和G的雜合子，2例弱D15型個(gè)體堿基序列在845位是G和A雜合子?；驕y(cè)序結(jié)果與熒光PCR方法結(jié)果一致。

3 討論

RhD血型系統(tǒng)中，RhD抗原在臨床輸血方面有著重要的意義。因RhD存在差異的表達(dá)情況，即為弱D、部分D以及Del型。弱D抗原為RHD基因錯(cuò)義性突變，導(dǎo)致細(xì)胞膜上或細(xì)胞膜內(nèi)部分氨基酸改變?cè)斐?，現(xiàn)被報(bào)道已超過(guò)40種。部分D的分子基礎(chǔ)是RHD基因與RHCE基因之間的堿基交換，形成多處突變，但RHD基因的正常閱讀框架不變。Del則是D抗原數(shù)量少與結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，只能通過(guò)吸收放散方法檢測(cè)出。由于現(xiàn)存在抗D血清試劑的局限性，以及吸收放散實(shí)驗(yàn)不作為常規(guī)檢查方法，使醫(yī)院輸血科以及血站進(jìn)行常規(guī)RhD陰性血型血清學(xué)確認(rèn)時(shí)，存在漏檢現(xiàn)象，誤將表達(dá)較弱的弱D以及Del血樣鑒定為陰性血。為降低臨床輸血風(fēng)險(xiǎn)，則有必要結(jié)合分子生物學(xué)方法準(zhǔn)確鑒定其基因型，分析分子背景。

本研究提示長(zhǎng)春地區(qū)初篩RhD陰性的人群中存在一定比例的D變異型，其中大多數(shù)為Del型個(gè)體,且均攜帶1227G>A 等位基因；其次為弱D15型G282D[RhD(845G>A)/d]型。這與其他研究的結(jié)果相一致：中國(guó)人漢族人群中Del和弱 D15 型是最常見的D變異型[7-8]，但是本研究未發(fā)現(xiàn)另外一種常見的D變異型DVI，今后需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。在臨床輸血方面，具有RHD*1227基因的Del型個(gè)體紅細(xì)胞，也會(huì)引起免疫回憶反應(yīng)[9]；但攜帶有RHD*1227A等位基因的孕產(chǎn)婦，卻可以不用接受定期的抗體效價(jià)的檢測(cè)及抗D免疫球蛋白的治療[10]；去除Del，已報(bào)道的中國(guó)人群D變異型主要是弱D15型，此種個(gè)體RhD抗原表位缺失，在D陽(yáng)性完全抗原的刺激下，可產(chǎn)生同種抗D抗體[11]，所以現(xiàn)階段受血者均作為D陰性對(duì)待。

目前常用的RHD基因檢測(cè)方法有PCR-SSP、高分辨率溶解曲線技術(shù)。因PCR-SSP方法需要電泳步驟，耗時(shí)長(zhǎng)，且存在假陰性、假陽(yáng)性；高分辨率溶解曲線技術(shù)對(duì)設(shè)備要求高，使以上兩種方法應(yīng)用存在困難。本研究采用熒光PCR方法，結(jié)合血清學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確鑒定常見RhD變異型，可以有效減少工作量，并保證臨床輸血安全。