姜黃素聯合TRAIL誘導人卵巢癌細胞的凋亡及其相關機制

王 敏，曾祚萍，李佳慧，崔君澤，楊淑莉

(吉林大學第二醫院 婦產科，吉林 長春130041)

卵巢癌可發生在任何年齡段，50歲以上女性為主要發病群體，通常發現即為晚期，預后較差[1]。卵巢癌患者在持續化療過程中機體會出現耐藥，并且耐藥程度會逐漸增加[2]。TRAIL作為TNF相關凋亡的誘導配體，其自身不具明顯毒性，TRAIL能上調DR4、DR5的表達從而發揮殺滅腫瘤細胞的作用[3]。姜黃植物根莖的姜黃素經相關研究顯示其抗氧化、抗癌及抗炎癥方面具有顯著優勢，如配合其他藥物聯用可能發揮抗癌功效，促進癌細胞凋亡[4-5]。本文探討姜黃素聯合TRAIL誘導人卵巢癌細胞的凋亡及其相關機制，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料SKOV-3和OVCAR-3細胞株由吉林大學第二醫院實驗室提供，重組人TRAIL蛋白購自美國RD公司，MTT、DMSO自美國Sigma公司購入，美國Hyclone公司的RPMI1640培養基，細胞凋亡檢測試劑盒美國BD公司購置，Caspase活性檢測試劑盒由江蘇碧云天生物技術研究所支持，酶標儀為美國雷勃公司Thermo Multiskan MK3，流式細胞儀采用美國BD公司Accuri。

1.2 方法

1.2.1細胞復蘇、培養、傳代及凍存 將凍存管從-150℃超低溫冰箱中取出置于37℃水浴箱中，自主晃動使其融化，將細胞懸液放入離心管。將SKOV-3和OVCAR-3細胞株分別置于5 ml含10%新生牛血清RPMI1640培養基，打碎均勻后經800 rpm離心，棄上清，于細胞培養瓶中接種后置于37℃、5%CO2條件下培養，至80%-90%細胞貼壁覆蓋進行傳代，將舊培養液棄除，并用PBS緩沖液沖洗細胞，在1 ml 0.25%胰酶條件下鏡下觀察，當細胞質圓潤、回縮時加入10%新生牛血清2 ml培養基。將貼壁細胞予以離心處理，按1∶2比例將沉淀白色細胞接種至新培養瓶，置于37℃、5%CO2條件繼續培養。取對數生長期細胞，以DMSO/新生牛血清1∶9混合為細胞凍存液，予以離心處理后凍存重懸細胞，濃度調整為1×107/ml，以1 ml進行分裝，最終凍存于-150℃超低溫冰箱。

1.2.2分組及給藥 設置空白對照組(僅SKOV-3和OVCAR-3培養基)、姜黃素組(予以姜黃素濃度為10 μmol/L及50 μmol/L的SKOV-3和OVCAR-3培養基)、TRAIL組(予以重組人TRAIL蛋白濃度為25 ng/ml及75 ng/ml的SKOV-3和OVCAR-3培養基)及姜黃素聯合TRAIL組(不同濃度姜黃素與不同濃度的重組人TRAIL蛋白兩兩配比的SKOV-3和OVCAR-3培養基)。每組3復孔，至70%-80%細胞貼壁融合，作24 h同步化處理后施加相應濃度藥物，置于37℃、5%CO2條件繼續培養24 h。

1.3 觀察指標觀察四組細胞活力，細胞凋亡，caspase-3、caspase-8及caspase-9活化的表達水平。其中，①細胞活力：由MTT法檢測，細胞活力百分比=(試驗吸光度)/(空白對照吸光度)×100%；②細胞凋亡：采用流式細胞術;③caspase-3、caspase-8及caspase-9的表達水平：用Western blot檢測caspase-3、caspase-8及caspase-9活化，由Caspase活性檢測試劑盒測定。

1.4 統計學分析采用SPSS22.0軟件作處理分析，以“均值±標準差”表示，細胞活力，細胞凋亡，caspase-3、caspase-8及caspase-9活化的表達水平采用t檢驗，若P<0.05，差異認定為有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞活力及增殖抑制效果姜黃素組細胞活力比較，不同濃度下，姜黃素作用于SKOV-3及OVCAR-3細胞的時間越長，細胞活力越低，且兩組細胞在姜黃素濃度為50 μmol/L、吸光度時間為48 h時細胞活力達到最低，均低于空白對照組(P<0.05)；TRAIL組細胞活力比較，不同濃度下，重組人TRAIL蛋白作用于SKOV-3及OVCAR-3細胞吸光度的時間越長，細胞活力越低，且兩組細胞均于75 ng/ml、吸光度48 h時細胞活力達到最低，與對照組比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)；姜黃素組+TRAIL組兩兩配比不同濃度下，濃度為(10 μmol/L+25 ng/ml)條件下，SKOV-3及OVCAR-3細胞活力隨作用時間增加而下降，在(50 μmol/L+75 ng/ml)條件下，SKOV-3及OVCAR-3細胞活力在吸光度48 h時達到最低，與空白對照組比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表1、2、3。

表1 姜黃素組細胞活力

表2 TRAIL組細胞活力

表3 姜黃素組聯合TRAIL組細胞活力

2.2 細胞凋亡統計SKOV-3及OVCAR-3細胞中各組細胞凋亡率，姜黃素組、TRAIL組及姜黃素組+TRAIL組的細胞凋亡率均高于空白對照組(P<0.05)，且姜黃素組+TRAIL組，不同配比濃度下的凋亡率均大于相應劑量姜黃素組及TRAIL組凋亡率(P<0.05)，見表4。

表4 細胞凋亡

2.3 caspase-3、caspase-8及caspase-9活化姜黃素組、TRAIL組及姜黃素組+TRAIL組caspase-3、caspase-8及caspase-9活化水平與空白對照組比較，均高于空白對照組(P<0.05)，且其中caspase-3活化水平存在顯著提升(P<0.05)，見表5、6、7。

表5 姜黃素組caspase-3、caspase-8及caspase-9活化

表6 TRAIL組caspase-3、caspase-8及caspase-9活化

表7 姜黃素組+TRAIL組caspase-3、caspase-8及caspase-9活化

3 討論

據2015年中國癌癥統計數據報告指出：中國卵巢惡性腫瘤發病率為 52.1/10萬，死亡率為22.5/10萬，對女性生命健康造成極大威脅[6-7]。卵巢惡性腫瘤無典型早期癥狀，故篩查、診斷難度較高，多數患者首次就診已為中晚期[8]。目前以根治術輔助化療為主要治療手段，可有效抑制腫瘤細胞活性，但持續治療過程中，機體耐藥性上升。TRAIL是TNF超家族成員之一，能特異性誘導腫瘤細胞凋亡，且對正常細胞不具毒性，是臨床公認的一種抗腫瘤藥物[9-11]。姜黃素為一類植物多酚類化合物，毒性及副作用較小，加上對腫瘤細胞活性有抑制作用，還可與其他化療藥物聯合使用提高療效[12]。本文通過探究姜黃素聯合TRAIL誘導人卵巢癌細胞的凋亡及其相關機制，為卵巢癌的治療提供新思路。

據Iqbal B等學者[13]研究指出：KCL-22髓樣細胞施以不同濃度的姜黃素及TRAIL的抗腫瘤效果與單一用藥相比，細胞活力明顯降低，且該研究認為caspase-3活性增強、NF-κB活性抑制與KCL-22細胞凋亡有一定的關聯。本研究則分析了姜黃素、TRAIL在不同濃度下，細胞活力和凋亡情況與作用時間的關系，結果顯示：姜黃素組+TRAIL組兩兩配比濃度下作用于SKOV-3及OVCAR-3細胞，隨作用時間延長，于48 h時，兩組細胞活力均在配比濃度(50 μmol/L+75 ng/ml)時細胞活力達到最低，且通過抑制率公式計算分析，該時點的抑制率最高。據此可知姜黃素聯合TRAIL可發揮細胞增殖抑制效果，在高濃度長時點下細胞增殖抑制效果明顯提升。而姜黃素組+TRAIL組配比濃度為(50 μmol/L+75 ng/ml)時的腫瘤細胞凋亡效果最佳，與同一濃度下單一藥物凋亡率比較，聯合用藥凋亡率明顯更高，推測上述兩種藥物聯合應用可發揮協同效果，誘導凋亡效果更佳。究其原因，可能與Obaidi I等學者[14]及Kong WY等學者[15]相關研究中TRAIL所起增敏效果與人乳腺腺癌細胞誘導凋亡有密切聯系。另從caspase-3、caspase-8及caspase-9活化結果表明：姜黃素組+TRAIL組中caspase-3活性變化幅度相較于caspase-8及caspase-9活化更高，具有明顯差異，分析原因可能caspase-3屬與誘導凋亡必要通路有關。這與據Kamat AM等學者[16]研究報道所稱姜黃素可通過抑制NF-κB和誘導膀胱癌細胞中的TRAIL受體來增強BCG的抗腫瘤作用結果相似。現從分子生物學、細胞學、組織學等角度上分析姜黃素的抗腫瘤細胞作用機制，可能因素如下[17]：①在分子水平上，腫瘤細胞攝取姜黃素，藥物作用靶點增加，可調節腫瘤細胞的信號轉導，從而促進腫瘤細胞中某些酶、蛋白質和基因的表達；②在細胞水平上，姜黃素抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，腫瘤細胞多藥耐藥情況得以逆轉，進而增強NK細胞的細胞毒性；③在組織水平上，可抑制腫瘤血管生成。同時，姜黃素對人體的毒性和副作用較小，比一般化療藥物更能特異性地殺傷腫瘤細胞，且可聯合其他藥物增加放化療對腫瘤細胞的殺傷作用。這與Kamalabadi-Farahani M等學者[18]研究報道DR-5基因在原發性和轉移性腫瘤細胞中均上調，但與轉移性細胞相比，原發性腫瘤細胞中上調幅度更高，呈一定相關性。

綜上所述：姜黃素聯合TRAIL對于卵巢癌具有細胞增殖抑制效果，可通過增強caspase-3活性有效誘導了細胞凋亡，以50 μmol/L姜黃素+75 ng/ml重組人TRAIL蛋白誘導效果最佳，在考慮毒性情況下合理配比，可提升卵巢癌臨床治療效果，在后續卵巢癌研究中具有一定參考價值。