真菌熒光染色法在皮膚淺部真菌感染中的應用研究

林寧寧,張路方,楊正生,楊會君,宋鐵軍,王麗兵

(秦皇島市第一醫院 皮膚科,河北 秦皇島066000)

皮膚淺部真菌疾病的重要輔助檢查手段為真菌直接鏡檢，其中常見的真菌鏡檢方法為濃度為10%的KOH濕片法[1]，雖然該診斷方法流程簡易，然而其診斷準確率低，尤其是對甲癬的臨床檢出率更低，容易引起誤診或者漏診[2-3]。近年來，真菌熒光染色法被廣泛地用于皮膚淺部真菌檢測之中。本研究通過對比10%的KOH濕片法與真菌熒光染色法檢測皮膚淺部真菌的效果，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年7月至2020年7月皮膚科就診的皮膚淺部真菌感染的114例患者作為觀察組，其中男63例，女51例；年齡最小4歲，最大71歲，平均年齡(35.35±6.35)歲；類型：手足癬、體股癬、花斑糠疹及甲癬例數分別為42例、29例、20例及23例，所有標本一式兩份。另外選擇同期接受體檢的健康者108例作為對照組，其中男59例、女49例；年齡最小6歲，最大69歲，平均(37.05±6.42)歲。

1.2 方法

1.2.1試劑及相關器材 (1)KOH溶液：選自于本院檢驗科配制的濃度為10%的KOH溶液；(2)熒光染液：主要包括KOH、伊文思藍、熒光增白劑以及純水等成分，均購自于北京索萊寶科技有限公司；(3)顯微鏡：選擇上海寰熙醫療器械有限公司生產的XT-X-4B型顯微鏡(批準文號：蘇食藥監械(準)字2013第2221196號)，增加熒光模塊。

1.2.2取材 使用蘸有濃度為75%乙醇的無菌棉簽浸潤及消毒皮損處，皮屑標本選擇活動性皮損邊緣位置的皮屑；甲屑標本選擇增厚混黃伴鱗屑、空變病甲碎屑；毛發選擇皮損內病發與毛根鱗屑。上述標本均一式兩份，分別實施KOH濕片法與熒光染色法進行檢測。

1.2.3KOH濕片法 向標本上滴加一定量的KOH溶液，并將蓋玻片蓋上，使用酒精燈進行加熱，于顯微鏡(×200)下對視野進行觀察。

1.2.4熒光染色法 于標本上滴加一定量的熒光染色液，將蓋玻片蓋上，染色3-5 s，將多余熒光染色溶液吸干凈，于顯微鏡(×200)熒光模塊下進行觀察。

1.3 相關指標檢測方法首先抽取2組入選對象清晨空腹狀態下肘靜脈血5.0 mL，3 000 rpm轉速下離心5 min，分離血清，置于-80℃冰箱中，待測。采用酶聯免疫吸附法對血清白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)進行測定，采用流式細胞學檢測方法對T淋巴細胞亞群相關指標(CD3+、CD4+、CD8+)進行測定。

2 結果

2.1 2種檢測方法檢測效果對比2種檢測方法檢測效果分別見圖1、2。KOH濕片法背景昏暗且雜亂，反差較小，真菌結構與雜質之間無法清晰鑒別；熒光染色法鏡下能夠清晰地觀察到真菌輪廓，呈亮藍色，菌絲也可明顯觀察到，菌絲與周圍背景之間容易辨別。

圖1 熒光染色法鏡下真菌形態(×200) 圖2 10%KOH 染色法鏡下真菌形態(×200)

2.2 2種方法檢測結果對比熒光染色法對手足癬、體股癬、花斑糠疹、甲癬檢出率及總檢出率分別為80.95%、96.55%、85.00%、91.30%及87.72%，均顯著高于KOH濕片法(分別為45.24%、75.86%、45.00%、60.87%及56.14%)(P均<0.05)，見表1。

表1 2種方法檢測結果比較[n(%)]

2.3 對照組與觀察組外周血T淋巴細胞相關指標水平對比觀察組外周血T淋巴細胞相關指標水平均顯著低于對照組(P均<0.05)，見表2。

表2 兩組外周血T淋巴細胞相關指標水平比較

2.4 對照組與觀察組血清相關炎性因子水平對比觀察組血清IL-2水平顯著低于對照組(P均<0.05)，觀察組血清IL-4及IL-10水平顯著高于對照組(P均<0.05)，見表3。

表3 兩組血清相關炎性因子水平比較

3 討論

皮膚淺部真菌感染性皮膚病是臨床上較常見的一種皮膚病，目前常見的真菌檢測方法包括：熒光染色法與KOH濕片法等[4-5]。本研究結果顯示熒光染色法對手足癬、體股癬、花斑糠疹、甲癬檢出率及總檢出率均分別顯著高于KOH濕片法(P均<0.05)。杜鵬等[6]研究結果顯示：熒光染色法對真菌陽性檢測率為90.6%，顯著高于10%KOH濕片法(67.4%)(P<0.05)；徐艷等[7]研究結果顯示：熒光染色法對真菌陽性檢測率為80.95%，顯著高于10%KOH濕片法(55.23%)(P<0.05)。此外，在實際檢測過程中，發現熒光染色法還能夠對蓋玻片及標本中可能存在微量的植物纖維素進行標記，并與真菌進行有效地區分及鑒別[8]。

細胞免疫通過對T淋巴細胞亞群各相關指標水平進行調節，促使機體保持穩定的免疫環境，本研究結果顯示觀察組外周血T淋巴細胞相關指標(CD3+、CD4+、CD8+)水平均顯著低于對照組(P均<0.05)，表明當機體發生皮膚淺部真菌感染時，患者免疫水平顯著下降。有研究顯示[9-10]，機體細胞因子與T淋巴細胞功能之間存在緊密的關聯性，當機體受到真菌等感染時，Th1/Th2淋巴細胞免疫會發生失衡，進而使促進免疫殺傷性細胞因子和免疫保護作用的細胞因子發生變化，本研究結果顯示IL-2表達水平降低，而IL-4及IL-10表達水平升高，提示當機體發生淺部皮膚真菌感染時，Th1/Th2淋巴細胞免疫失衡。

綜上所述，與10%KOH濕片法相比，真菌熒光染色法在皮膚淺部真菌檢測中的應用效果更佳；且皮膚淺部真菌感染與T淋巴細胞及相關炎性因子表達之間存在緊密的關系。