腎透明細胞癌患者術前血漿GAPDH cfNA水平對診斷及預后的價值

邱 實,陳 坤,衣 琳,于越海

(1.吉林化工醫院 a.放化療科;b.老年病科，吉林 吉林132000；2.吉林大學中日聯誼醫院 泌尿外科)

腎透明細胞癌(ccRCC)是最常見的腎惡性腫瘤[1]，但由于缺乏特異性的生物標志物，目前臨床上對于ccRCC預后的判斷仍然依賴患者或腫瘤的臨床和病理特征。尋找一種有效的生物標志物對于ccRCC患者的術后檢測以及管理至關重要[2]。循環腫瘤細胞(CTCs)已經被證明在腎細胞癌患者的早期診斷和預后中具有潛在的應用價值[3-4]。血漿游離核酸(cfDNA和cfRNA)比CTC的檢測更簡單，且重復性更高。甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為管家基因(housekeeper gene)，多用于測定其他基因轉錄或蛋白表達的內參。最近一些研究發現，GAPDH[LS4]也可以作為一種獨立的腫瘤生物標志物[5]。本研究擬觀察ccRCC患者術前血漿中GPADH的cfDNA和cfRNA對診斷及預后的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料納入2015年1月至2015年6月，于吉林大學中日聯誼醫院泌尿外科行手術治療的腎透明細胞癌患者50例，收集患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、Fuhrman分級等臨床病理特征，并于手術前采集外周血標本。另收集同期20例健康人的外周血標本。

1.2 血標本處理方法每例外周血標本約10 ml，用含EDTA的采血管收集。收集后立刻1 500 rpm離心10 min，小心將上層血清轉移至新的、無DNA酶和RNA酶的離心管中，再次2 000 rpm離心10 min，收集上層血漿標本，置于-80℃冰箱中保存。所有離心操作，離心機溫度均為4℃。

1.3 血漿cfDNA和cfRNA的提取本次研究應用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit試劑盒(QIAGEN,德國，貨號：55114)提取血漿中的cfDNA和cfRNA。分別取1 ml血漿標本，根據試劑盒說明書進行操作，提取得到cfDNA后，置于-20℃冰箱中保存。提取得到cfRNA后，進行逆轉錄，將cDNA置于-20℃冰箱中保存。

1.4 DNA與cDNA的量化應用熒光雜交探針對提取的DNA和cDNA進行實時定量PCR(RT-qPCR)，擴增GAPDH與hTERT的特異性序列。GAPDH正向引物序列為：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，反向引物序列為：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。應用TaqMan探針進行定量，探針序列為：5’-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA。構建10 μl的RT-qPCR體系：cDNA模板1 μl，正反引物各0.2 μl，Mix 5 μl，染料(50×)0.2 μl，最后用無酶水補齊至10 μl。循環數為45，PCR條件：95℃ 10 min后進入擴增循環，95℃ 15s，60℃ 60 s，45個循環后，95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s，后冷卻至4℃。

1.5 復查與隨訪方法患者術后前2年，每3個月復查一次，第3年至第5年，每半年復查一次。復查內容包括體格檢查、血常規、血生化、腫瘤標志物、超聲、CT等。隨訪采用電話或門診隨訪。總生存期(Overall Survival，OS)定義為自手術次日至患者死亡，或最后一次隨訪。

1.6 統計學方法應用SPSS 24.0對所有數據進行統計分析，數據用(均數±標準差)的形式表示。計量資料兩組間比較采用Student’st檢驗，多組間比較采用方差分析。Kaplan-Merier法計算OS、CSS和PFS。以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床病理資料納入50例ccRCC患者中，男性36例(72%)，平均年齡(66.3±7.6)歲；20例健康人中，男性13例(65%)，平均年齡(63.6±8.1)歲。兩組在性別組成和平均年齡上無顯著差異(P>0.05)。ccRCC患者病理資料見表1。

表1 一般臨床資料

2.2 術前血漿cfDNA與cfRNA在診斷中的價值在所有ccRCC患者和健康人的血漿中均檢測到了GAPDH的cfDNA和cfRNA。在ccRCC患者和健康人血漿中，GAPDH的cfDNA平均濃度分別為(30.63±28.18)fg/ml和(1.35±1.68)fg/ml，兩組存在統計學差異(P<0.001)。以1.35 fg/ml作為診斷臨界值，其靈敏度為91.49%，特異度為69.57%。ROC曲線下面積(AUC)為0.897(0.825-0.969；P<0.001)。

在ccRCC患者和健康人血漿中，GAPDH的cfRNA平均濃度分別為(109.68±85.45)fg/ml和(17.84±7.48)fg/ml，兩組存在統計學差異(P<0.001)，以17.84 fg/ml作為診斷臨界值，其靈敏度為81.25%，特異度為50%。ROC曲線下面積(AUC)為0.811(0.712-0.910；P<0.001)。

2.3 術前血漿cfDNA與cfRNA水平與腫瘤病理參數的關系ccRCC患者術前血漿GAPDH cfDNA水平與T分期和TNM分期有關，T3-T4期和Ⅲ-Ⅳ期患者血漿GAPDH cfDNA水平顯著高于T1-T2期和Ⅰ-Ⅱ期患者。而cfRNA水平與T分期、N分期、M分期和TNM分期均呈正相關。見表2。

表2 術前血漿cfDNA與cfRNA水平與腫瘤病理參數的關系

2.4 術前血漿cfDNA與cfRNA水平與預后的關系多因素COX回歸分析結果提示，M分期、TNM分期，以及術前GAPDH cfDNA和cfRAN水平是影響ccRCC患者OS的獨立危險因素。存在遠處轉移(M1期)、高TNM分期與較差的OS有關，而且，術前GAPDH cfDNA每升高1 fg/ml，死亡風險增加3.1%，GAPDH cfRNA每升高1 fg/ml，死亡風險增加4.2%。見表3。

表3 影響OS的多因素回歸分析

3 討論

目前，血漿cfNA在臨床中的價值已經在多種腫瘤中得到證實[6-7]，但在腎透明細胞癌中的研究相對較少。現有研究結果表明，腎細胞癌(RCC)患者血漿中中-小片段cfDNA水平與健康者無顯著差異，但大片段cfDNA水平要顯著高于健康人群，尤其是發生遠處轉移的患者[8-9]。

本研究發現術前ccRCC患者血漿中GAPDH cfDNA與cfRNA水平較健康人群顯著升高，這為以這兩種分子作為診斷工具提供了可能。本研究以GAPDH cfDNA與cfRNA在健康人血漿中的平均水平作為臨界值，當用cfDNA進行診斷時，靈敏度高達91.49%，但特異度較差，為69.57%；當用cfRNA 進行診斷時，靈敏度為81.25%，但特異度僅為50%。關于血漿cfNA作為診斷工具的靈敏度和特異度，現有文獻報道差異較大。造成這種差異的原因可能與腫瘤異質性、檢測方法、甚至是引物序列有關[3]。本研究中cfNA的特異度均不理想，除了上述原因之外，也可能與樣本量較少有關，尤其是健康人群數量較少，造成診斷范圍可能出現較大偏差。

本研究發現在T3-T4期和TNM Ⅲ-Ⅳ期的患者中，血漿cfDNA和cfRNA水平顯著升高，且cfRNA水平還與N分期和M分期顯著相關，但二者均與Fuhrman分級無顯著相關性。這與其他研究結果相似[10]。De Martino等研究認為，cfDNA水平可能與腫瘤壞死相關，晚期腫瘤可能具有更大的腫瘤壞死面積，故造成血漿cfDNA水平升高[9]。

在預后方面，術前血漿中GAPDH cfNA水平是影響ccRCC患者OS的獨立危險因素。先前有研究發現，RCC患者術后血漿中cfDNA水平與復發和預后有關。本研究結果提示術前血漿GAPDH cfDNA和cfRNA可能對預后也有一定的預測價值。

綜上，術前血漿GAPDH cfDNA和cfRNA可以作為ccRCC的診斷和預后的生物標志物。