瘢痕疙瘩成纖維細胞源性P物質在瘢痕疙瘩發病機制中的作用

李香蘭，黃哲浩，姜日花*，池光范

(1.吉林大學中日聯誼醫院 a.皮膚科；b.神經外科，吉林 長春130033；2.吉林大學病理生物學教育部重點實驗室)

P物質(SP)是含有11個氨基酸的神經肽。研究表明，感覺神經通過釋放SP等神經肽[1]，參與皮膚炎癥和創傷后修復[2]。軟組織損傷刺激這些傳入神經末梢釋放SP，影響神經源性炎癥和成纖維細胞增殖[3]。Nilsson等的研究發現增生性瘢痕中SP陽性神經纖維增多，提示SP可能參與了病理性瘢痕的形成[4]。本研究基于觀察瘢痕疙瘩成纖維細胞源性SP對瘢痕疙瘩成纖維細胞外基質沉積的作用及對成纖維細胞遷移的影響，探討其機制及相關治療方案。

1 材料與方法

1.1 收集瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織

收集了2017年至2019年就診于吉林大學中日聯誼醫院患者的瘢痕疙瘩組織樣本20例，包括前胸、后背的瘢痕疙瘩10例，耳部瘢痕疙瘩10例。同時收集了前胸及后背正常皮膚組織樣本10例，組織樣本均來自本院皮膚科。所獲取的組織經福爾馬林固定制作蠟塊組織標本及組織切片，進行HE染色及組織免疫化學染色。收集了3例新鮮瘢痕疙瘩組織及3例正常新鮮皮膚組織，用于分離培養瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細胞。

1.2 主要實驗試劑及儀器

SP免疫組織化學試劑盒(中國福州邁新生物技術有限公司)，DAB顯色液(中國福州邁新生物技術有限公司)，DMEM培養液(美國Gibco公司)，胎牛血清(以色列 BI 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1HE染色及免疫組織化學染色 所獲取的組織經福爾馬林固定制作蠟塊組織標本及組織切片，進行組織免疫化學染色。

1.3.2皮膚成纖維細胞的分離培養 手術中切下的瘢痕疙瘩或正常皮膚組織移至無菌培養皿中；加入0.2%中性蛋白酶溶液，4℃，4-8小時；表皮層和真皮層分離，將真皮層反復剪切至泥狀，加入Ⅰ型膠原酶溶液，37℃搖床，3-5小時；加入等量培養基終止消化，反復吹吸，80目濾網過濾；離心，保留沉淀，培養基重懸細胞；接種細胞至培養瓶中，置入37℃含有5%CO2的培養箱中培養。

1.3.3細胞免疫熒光染色 取對數期生長的成纖維細胞；使用6孔板鋪板；24小時后使用 4%多聚甲醛固定細胞；0.1%Triton-X100孵育20 min；BSA封閉30 min；SP抗體封閉過夜(1∶50，Santa Cruz)；去除一抗，加入熒光二抗(1∶200,abcam)，避光，孵育2 h；用含DAPI的封閉液封片；在倒置顯微鏡下，觀察照相。

1.3.4TAC1 siRNA轉染 使用lipofectamine2000(lipo2000，Invitrogen)轉染，轉染按照試劑盒說明書操作。TAC1 siRNA 由廣州銳博生物提供，siG000006863B，序列為AAGACGTTAATAAACTACC，轉染濃度為50 nM。

1.3.5Western Blot 提取蛋白、測蛋白濃度；配膠，煮蛋白上樣；進行蛋白質電泳濃縮、分離和轉膜，5%脫脂奶粉封閉；一抗孵育：Substance P(1∶500，Novus)，Collagen I(1∶5 000，Abcam)，Collagen III(1∶5 000，Abcam)，4℃過夜；二抗(山羊抗兔Ig G-HRP 抗體,1∶5 000，中國北京中杉金橋生物有限公司)孵育；ECL顯色液反應顯色，在凝膠圖像分析儀拍照。

1.3.6細胞劃痕實驗 瘢痕疙瘩成纖維細胞進行TAC1 siRNA轉染24 h后，用20 μl無菌槍頭沿培養板底部劃一 直線，PBS緩沖液沖洗以去除漂浮細胞，加入無血清培養基繼續培養24小時，倒置顯微鏡觀察劃痕區相對距離。

1.3.7統計學方法 GraphPad prism 5.0軟件進行統計學分析，組間差異比較采用t檢驗，數據采用平均值±SD 表示。

2 結果

2.1 瘢痕疙瘩組織的病理學特點

瘢痕疙瘩組織具有過度生長、病變的發展超出原損傷界限、呈瘤樣增生等特征。HE染色提示瘢痕疙瘩組織中成纖維細胞過度增生，細胞外基質成分增加，膠原蛋白過度沉積(圖1)。

圖1 H&E染色 瘢痕疙瘩組織中成纖維細胞過度增生，細胞外基質成分增加，膠原蛋白過度沉積

2.2 瘢痕疙瘩組織中SP表達增加

免疫組織化學染色結果顯示，與正常皮膚組織相比瘢痕疙瘩組織SP抗原抗體反應顯著陽性，主要表達在真皮層瘢痕疙瘩細胞外基質和纖維細胞的細胞質中。定量分析結果顯示與正常皮膚組織相比有顯著的統計學意義(P<0.01，圖2)。

A:瘢痕疙瘩組織高表達SP。B:與正常皮膚組織相比均有顯著的統計學意義，P<0.01。

2.3 瘢痕疙瘩成纖維細胞的形態觀察

在倒置相差顯微鏡下，培養得到的瘢痕疙瘩成纖維細胞表現為形態肥大，體積明顯大于正常的成纖維細胞(圖3)。

圖3 倒置相差顯微鏡顯示的瘢痕疙瘩成纖維細胞形態，該細胞形態肥大，體積明顯大于正常的成纖維細胞

2.4 瘢痕疙瘩成纖維細胞中SP高表達

細胞免疫熒光染色顯示，與正常皮膚組織相比瘢痕疙瘩組織SP抗原抗體反應顯著陽性，主要表達在成纖維細胞的細胞質中。定量分析結果顯示與正常皮膚組織相比有顯著的統計學意義(P<0.01，見圖4)。

A:瘢痕疙瘩成纖維細胞高表達SP。B:與正常皮膚成纖維細胞相比有顯著的統計學意義，P<0.01。

2.5 敲減TAC1基因后瘢痕疙瘩成纖維細胞SP、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白表達減少

TAC-1基因轉錄翻譯為SP蛋白。應用siRNA干擾技術敲減TAC-1基因表達后，與正常成纖維細胞相比瘢痕疙瘩成纖維細胞顯著減少SP、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen I)及Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)的表達，均有顯著的統計學意義(P<0.01，見圖5)。

敲減TAC-1基因后，瘢痕疙瘩成纖維細胞減少表達SP、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋(P<0.01)。

2.6 敲減TAC1明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的移行能力

未敲減 TAC1的瘢痕疙瘩成纖維細胞(對照組)與敲減 TAC1的瘢痕疙瘩成纖維細胞(實驗組)相比，在劃痕形成24小時后，已有大量成纖維細胞向劃痕處移行，劃痕界面已基本愈合，但是實驗組仍然觀察到了無細胞的明顯的劃痕界面，劃痕面積統計結果顯示有顯著的統計學意義(P<0.01，圖6)。

敲減 TAC1的實驗組劃痕愈合能力明顯低于對照組，有統計學意義，P<0.01

3 討論

瘢痕疙瘩是一種與遺傳及免疫功能等因素有關的皮膚成纖維細胞異常增生性疾病[5]。此次實驗中，瘢痕疙瘩組織HE染色表現為成纖維細胞過度增生，細胞外基質成分增加，膠原蛋白過度沉積，呈瘤樣增生等特點，與以往的其他研究結果相一致。

SP在人類和嚙齒動物中廣泛表達，并在各種生物過程中發揮多種作用。Euler和Gaddum[6]首次報道了SP對胃腸道平滑肌的舒張和收縮作用。隨后的研究表明，SP是一種與疼痛傳遞相關的神經元感覺介質，因為它在脊髓背根高度集中，SP還與神經元組織[7]、炎癥[8]和痛覺的生長發育有關[9]。本研究免疫組織化學染色中，瘢痕疙瘩組織細胞外基質和成纖維細胞細胞質均高表達SP，提示SP不僅來源于真皮中的神經，與患者的瘙癢和疼痛等臨床癥狀正相關，還有瘢痕疙瘩成纖維細胞自身也合成分泌SP，通過自分泌和旁分泌作用調控瘢痕疙瘩中成纖維細胞的細胞特性，促進瘢痕疙瘩病理發展。SP在皮膚組織損傷后的病理生理作用，包括修復和異常增殖中的作用已被報道[10]。陳靜等在研究中發現在 SP 通過調控成纖維細胞凋亡相關基因-PCNA、bcl-2的表達而參與病理性瘢痕形成,該作用由 SP受體介導[11]。但這些研究主要集中在外來SP對成纖維細胞的影響。本研究發現敲減瘢痕疙瘩成纖維細胞的TAC-1基因后，瘢痕疙瘩成纖維細胞減少SP、Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的表達，推測瘢痕疙瘩成纖維細胞分泌的SP通過調控Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的表達進而介導細胞外基質的沉積，進一步促進瘢痕疙瘩的病理發展。

瘢痕疙瘩有向周邊侵襲生長的特性，這與成纖維細胞遷移能力有關。劃痕實驗中發現，敲減 TAC1的瘢痕疙瘩成纖維細胞劃痕界面中遷移能力顯著降低，提示瘢痕疙瘩成纖維細胞分泌的SP對瘢痕疙瘩成纖維細胞的移行能力有顯著性促進作用。國內其他學者認為[12]SP對成纖維細胞的促增殖作用可被它的神經激膚1(NK1)受體拮抗劑 spanitde 抑制或部分抑制,提示SP誘導的成纖維細胞增殖作用與NK1功能有關。說明應用NK1受體抑制劑，阻斷SP的作用不僅達到抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移，還能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和Ⅰ型及Ⅲ膠原細胞外基質的合成分泌，抑制瘢痕疙瘩生長和過度擴張，從而達到緩解治療瘢痕疙瘩的目的。

此次研究發現瘢痕疙瘩成纖維細胞合成分泌SP并進一步揭示了瘢痕疙瘩成纖維細胞來源SP在瘢痕疙瘩組織中的作用機制，為瘢痕疙瘩新藥物的開發研究提供了新的方向。