Ku70正向調控cGAS介導的天然免疫反應①

儲貝 孫欽秒（中國科學技術大學生命科學學院，合肥230027）

天然免疫系統作為機體抵御病原體入侵的第一道防線，在識別病原體和激發適應性免疫保護中發揮重要作用［1］。其免疫識別的分子機制是機體通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別病原體相關分子模式（pathogen associat‐ed molecular patterns，PAMPs）以及近年提出的損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），激活下游信號通路，產生促炎癥因子和干擾素，引發固有免疫應答［2-6］。其中，PAMPs是指由病原菌（如LPS）或病毒（如dsRNA/ssRNA/dsDNA/ssDNA）釋放的分子，而DAMPs是指由受損或死亡細胞釋放的內源性分子，如ATP、尿酸晶體及S100蛋白［7］。

目前，已知的PRRs包括膜結合的Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）和C型凝集素受體（C-typ‐electin receptors，CLRs）；胞質中的RIG-Ⅰ樣受體（RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs）、NOD樣受體（NODlike receptors，NLRs）及DNA感 受 器（DNA-depen‐dent activator of IRFs，DAI）等［8-9］。隨著PRRs研究深入，研究者對于其參加抗病毒應答分子機制的認識也更為深刻。

cGAS（cyclic GMP-AMP synthase）作為一種重要的胞質DNA識別受體，廣泛存在于哺乳動物各種從細胞。當cGAS識別內源或外源的非正常DNA后，自身激活，并將ATP和GTP催化合成cGAMP［10-13］。游離的第二信使分子cGAMP與定位于內質網的受體 蛋 白STING（stimulator of interferon genes）結合［14-15］。激活的STING構象發生改變，形成二聚體并招募下游TBK1激酶（TANK binding kinase 1）、NIK（NF-κB inducing kinase）和異三聚體IKK蛋白，形成龐大的信號復合物。其中，TBK1磷酸化下游IRF3（interferon regulatory factor 3）使其形成磷酸化二聚體，轉位進入核內，產生大量Ⅰ型干擾素，激活STING/TBK1/IRF3信號通路，觸發抗病毒反應［16-17］。

DNA依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）是一種主要定位于核內的Ser/Thr激酶［18-19］。DNA-PK是異源三聚體蛋白復合體，由異源二聚體Ku蛋白和1個約460 kD的催化亞基DNAPKcs共同組成。其 中，Ku蛋 白由70 kD的Ku70蛋白和80 kD的Ku80蛋白構成，該復合體蛋白在部分生物學過程中發揮關鍵作用，如固有免疫應答、非同源末端連接（NHEJ）、V（D）J重組、細胞凋亡、端粒維持與細胞衰老、DNA復制等［20-21］。

DNA-PK作為重要的胞質DNA受體，在抗病毒固有免疫反應中也發揮關鍵作用。研究發現，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察HEK293T細胞，內源Ku70蛋白定位于細胞核，DNA刺激時，Ku70出核靶定于胞質并與STING形成復合體，促進固有免疫應答反應［22］。敲低HEK293細胞中Ku70蛋白可有效抑制DNA誘導的IFN-λ1激活［23］。此外，成纖維細胞中，DNA-PK作為胞質受體，識別并結合牛痘病毒DNA，誘導產生Ⅰ型干擾素，引發機體下游免疫反應［24］。但DNA-PK是否參與cGAS/STING/TBK1/IRF3信號通路和具體調控機制尚未明確。

因此，本研究通過免疫共沉淀與質譜技術篩選得到與cGAS結合的Ku70蛋白，通過蛋白互作實驗檢測兩者是否存在相互作用。同時，在HEK293T細胞中過表達Ku70，利用熒光素酶報告基因實驗探究Ku70是否參與cGAS介導的信號通路。敲低THP-1細胞中Ku70表達，利用Western blot和qPCR技術探究Ku70對cGAS-STING信號通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系人源HEK293T、THP-1細胞購自中科院上海細胞庫，儲存于液氮罐。參考ATCC數據庫，HEK293T培養于DMEM基礎培養基，THP-1細胞培養于RPMI1640基礎培養基，加入適量胎牛血清及雙抗。

1.1.2 主要試劑基礎培養基和雙抗溶液購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；轉染試劑Lipofectamine2000和OPTIMAL-MEM購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自ABM公司；SYBR Green染料購自康為公司；顯影發光底物購自Thermo Fisher；Herring testis DNA（HT-DNA）購自Sigma；分析化學試劑（乙醇、甲醇、異丙醇等）購自北京化工公司。實驗中所用DNA病毒為HSV-1（Ⅰ型單純皰疹病毒），Vero細胞擴增。

1.2 方法

1.2.1 細胞傳代超凈臺中棄原有培養基，1×PBS洗去殘留培養基，緩慢加入預熱胰酶，輕輕搖晃培養皿，置于培養箱1~2 min，輕輕拍打培養皿使細胞分散，加入新鮮培養基終止消化。收取細胞，離心，按適當傳代密度轉移細胞懸液至預先加有新鮮培養基的培養皿，均勻分布于培養皿，移至37℃細胞培養箱，完成細胞傳代工作。懸浮生長的細胞可直接收取細胞進行傳代，無需胰酶消化。

1.2.2 細胞轉染及敲低細胞系構建采用PEI、Li‐pofectamine2000轉染細胞，Lipofectamine2000轉 染按說明書操作。采用PEI在HEK293T細胞中過表達外源目的基因時，需保證細胞密度為70%~80%。取1個1.5 ml EP管加入Opti-MEM及目標質粒，另取1個1.5 ml EP管加入Opti-MEM，按質粒與PEI質量體積比為1∶2加入PEI，混勻2個EP管中液體，靜置8~10 min。將轉染液緩慢加入培養皿中，放回培養箱。PEI毒性較高，轉染后6~8 h需及時更換新鮮培養液。24~48 h后收取細胞，完成后續實驗。

采用RNA干擾技術沉默靶基因Ku70表達。設計針對Ku70基因的短發卡shRNA（靶向核酸序列：GAAGAGTCTACCCGACATAAG），通過慢病毒包裝的形式將shRNA轉入THP-1細胞。由于Plko.1載體中U6啟動子可保證shRNA長時程表達，從而篩選出Ku70敲低的THP-1穩定細胞系。

1.2.3 Western blot棄細胞培養基，1×PBS清洗細胞。根據細胞量加入SDS loading buffer直接裂解細胞，98℃煮沸。將制備好的蛋白樣品進行電泳、轉膜、封閉，孵育盒中孵育一抗2 h。若目標蛋白為內源蛋白，則4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應鼠或兔二抗，繼續孵育1 h，TBST清洗3次，參照顯影試劑盒說明書配制顯影發光底物，置于底物溶液中孵育30 s，顯影儀下選擇合適曝光次數與時間掃描拍照。

1.2.4 免疫共沉淀采用6 cm培養皿進行HEK293T細胞內質粒轉染，過表達特定蛋白，研究蛋白相互作用。轉染24~48 h后收取細胞，并用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞，離心，取少量上清轉至新的EP管，加入SDS loading buffer，煮樣，作為Input樣品，檢測過表達蛋白表達。同時，將剩余上清轉至裝有活化beads的EP管，4℃旋轉混合儀內緩慢搖晃，孵育4~6 h或過夜。清洗3~4次，加入loading buffer，煮樣，作為IP樣品。Input和IP樣品進行后續Western blot實驗。

1.2.5 熒光素酶報告基因實驗24孔板中HEK293T細胞密度達60%~70%時，轉染一定量Re‐nilla、pGL3-IFN-β-luciferase或pGL3-ISRE-luciferase等質粒［25］。轉染24 h后，棄培養基，100 μl/孔加入裂解液，冰上裂解細胞10 min，離心，取20 μl上清依次加至干凈的96孔板，每孔定量加入50 μl Lucifer‐ase assay substrate，輕輕混勻液體，酶標儀測量熒光活性，以Renilla為內參，分析數據。

1.2.6 qRT-PCR根據RNA抽提試劑Trizol說明書提取THP-1細胞總RNA，Nanodrop2000測定RNA濃度。取2 μg RNA，參照Abm公司逆轉錄試劑盒，常規PCR進行cDNA合成反應。將反轉得到的cDNA與反應液加至96孔板，Bio-Rad Q-PCR儀中進行實時熒光定量PCR擴增。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統計學處理采用GraphPad Prism軟件進行統計學分析，t檢驗分析差異顯著性，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達Ku70與cGAS存在相互作用

HEK293T細 胞 中PEI轉 染HA-cGAS、HA-STING、Flag-Ku70質粒24 h，免疫共沉淀技術及Western blot分析蛋白相互作用，結果表明，HEK293T細胞中，外源過表達的Ku70蛋白和cGAS蛋白存在較強的相互作用，相反，STING蛋白與Ku70蛋白不存在相互作用（圖1）。

圖1 過表達Ku70與cGAS相互作用Fig.1 Overexpression of Ku70 interacts with cGAS

2.2 Ku70正向調控cGAS信號途徑體外實驗結果顯示，Ku70與cGAS有較強的相互作用，提示Ku70蛋白可能參與cGAS介導的抗DNA病毒天然免疫信號途徑。熒光素酶報告實驗結果顯示，HEK293T-STING-stable細胞中，cGAS表達顯著激活IFN-β表達，而Ku70與cGAS共表達顯著增強cGAS誘導的激活反應，且呈劑量依賴性，提示Ku70正向調控cGAS活性，促進cGAS誘導的Ⅰ型干擾素表達（圖2）。

圖2 過表達Ku70促進cGAS誘導的Ⅰ型干擾素表達Fig.2 Overexpression of Ku70 enhances cGAS-mediated typeⅠinterferon expression

2.3 Ku70不參與STING介導的信號途徑探究Ku70是否影響下游接頭蛋白STING活性，在HEK293T細胞中瞬時轉染ISRE報告基因，結果顯示，缺少STING的HEK293T細胞幾乎不表達ISRE，過表達STING顯著激活ISRE表達；Ku70或Ku70與STING共表達時，對STING誘導的ISRE激活無顯著影響，且無劑量依賴關系，提示Ku70主要調節STING上游信號轉導（圖3）。

圖3 Ku70過表達對STING介導的信號途徑的影響Fig.3 Effect of Ku70 overexpression on STING-mediated signaling pathway

2.4 敲低Ku70抑制DNA病毒誘導的IFN-β產生基于cGAS在宿主抵抗DNA免疫應答中的關鍵作用，探究Ku70是否影響HSV-1病毒及HT-DNA誘導的天然免疫信號轉導途徑。qPCR數據顯示，shRNA有效降低THP-1細胞中內源Ku70表達，靶向沉默序列有效。同時，Ku70敲低的THP-1細胞應對HSV-1感染和HT-DNA刺激時，與野生型細胞相比，其誘導的內源性IFNB1 mRNA含量明顯降低，表明敲低Ku70抑制宿主抗DNA病毒免疫應答（圖4）。

圖4 敲低Ku70抑制宿主抗DNA病毒免疫應答Fig.4 Knockdown Ku70 inhibits host immune response against DNA viruses

2.5 干擾Ku70表達抑制Ⅰ型干擾素信號通路活化Ku70敲低的穩定THP-1細胞系中，HT-DNA作為刺激物分別處理Plko.1和shKu70細胞，Western blot結果表明，HT-DNA刺激后，shKu70細胞中下游P-IRF3表達明顯降低，提示Ku70正向調控宿主抗DNA病毒天然免疫信號通路（圖5）。

圖5 降低Ku70表達下調HT-DNA誘導的IRF3磷酸化水平Fig.5 Ku70 silencing down-regulates phosphorylation levels of IRF3 induced by HT-DNA treatment

3 討論

cGAS是一種重要的胞質DNA識別受體，在抵御外界病原微生物及自身DNA引起的固有免疫應答中起重要作用［16，27］。但cGAS抗病毒天然免疫調控機制仍需進一步研究。本研究發現，同樣作為胞質受體分子的Ku70蛋白與cGAS蛋白存在相互作用，并通過促進Ⅰ型干擾素產生正向調控cGAS介導的抗DNA病毒天然免疫反應。根據已有研究報道，當識別病毒DNA后，活化的cGAS催化合成cGAMP，激活STING蛋白，進而觸發cGAS/STING/TBK1/IRF3信號通路，產生Ⅰ型干擾素的抗病毒反應，其中，cGAS識別并結合DNA是其發揮酶活性、激活下游通路所必需的［28］。Ku70能否作為“輔助者”通過促進cGAS有效識別并結合胞質或病毒DNA，進而增強cGAS酶活，最終發揮正向調控功能。與此同時，作為異源三聚體蛋白復合體，DNAPK中另外兩個成員（DNA-PKcs、Ku80）是否共同參與Ku70調控cGAS介導的抗病毒免疫應答？彼此間是否存在相互促進或競爭關系？實驗證明Ku70與cGAS存在較強的相互作用，這種相互作用是直接作用還是通過某個支架分子介導間接作用？針對以上問題，鑒于DNA感受通路影響多個生理過程和多種疾病，課題組將繼續深入探尋Ku70在cGAS介導的固有免疫信號通路中的精細調控機制，為機體抵御病原體入侵及相關疾病發生提供線索及潛在靶標。

近年關于cGAS的研究范圍越來越廣，也讓研究者充分認識到事物的多面性。除參與固有免疫應答，Ku70還參與調控非同源末端連接（NHEJ）、細胞凋亡、端粒維持與細胞衰老等［29-30］。與之相對應的cGAS也參與調控細胞周期與細胞衰老，在核內抑制同源重組介導的修復［31-32］。以上生物學事件中，Ku70與cGAS或許也存在某種特殊的調控關系，仍需進一步研究。