藍萼甲素通過cyclinB1/CDK1途徑誘導DU145細胞G2/M期阻滯①

朱琳琳 徐祉軒 張明明（新鄉(xiāng)醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，河南省分子檢驗與醫(yī)學檢驗技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省免疫與靶向藥物重點實驗室，新鄉(xiāng)453003）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）發(fā)病率逐年升高，現(xiàn)已成為嚴重威脅亞洲男性健康的第二大惡性腫瘤，但相當一部分患者激素治療不敏感或耐受，迫切需要尋找抗腫瘤效果明確但不良反應較小的藥物。本研究選取的藍萼甲素（glaucocalyxin A，GLA）是從傳統(tǒng)中草藥香茶菜中分離提取的活性成分，香茶菜作為中草藥，用于清熱解毒、抗菌消炎、抗腫瘤歷史悠久。研究表明GLA具有良好的抗腫瘤作用，但機制尚不明確［1-4］。本研究檢測GLA對人前列腺癌細胞系DU145細胞中周期蛋白B1（cy‐clinB1）、周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent ki‐nase1，CDK1）等細胞周期相關(guān)因子表達的影響，探討GLA誘導細胞周期阻滯的作用機制，為GLA的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人前列腺癌細胞系DU145細胞購自中科院上海細胞庫。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；GLA由新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院提供；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、實時熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；所用引物均由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成；所用抗體均購自美國CST公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、流式細胞周期檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；流式凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1 實驗分組實驗設(shè)空白對照組、1 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml GLA組，4組細胞培養(yǎng)基均含10%胎牛血清、100 U/ml雙抗（青鏈霉素），培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2。空白對照組不加GLA，其他各組細胞貼壁后分別加入相應濃度GLA刺激培養(yǎng)。

1.2.2 細胞增殖4組細胞接種于96孔板中，每孔體積100 μl，約2 000個細胞，細胞貼壁后加藥。各孔分別加入10 μl CCK-8溶液，96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出96孔板，置于酶標儀檢測位，振蕩混勻后，酶標儀450 nm測定各孔標本吸光度。

1.2.3 細胞周期細胞接種于6孔板中，約1×106個/孔，各孔細胞數(shù)量均勻。細胞貼壁后加藥，加藥后培養(yǎng)24 h，按試劑盒操作說明收集固定細胞，染色，上機檢測分析。

1.2.4 細胞凋亡細胞接種于6孔板中，約1×106個/孔。細胞貼壁后加藥培養(yǎng)24 h，收集細胞。預冷PBS洗滌細胞，Binding Buffer重懸細胞，Annex‐in V-FITC標記后避光、室溫孵育15 min，PI染色后上機檢測分析。

1.2.5 Real-time PCR Trizol一步法提取細胞總RNA，異丙醇法濃縮RNA，對RNA濃度和質(zhì)量檢測后進行逆轉(zhuǎn)錄，并按試劑盒操作說明完成qRTPCR。qRT-PCR反應條件為95℃預變性10 min，95℃變性15 s與60℃退火/延伸60 s進行40個循環(huán)，最后分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法（其中Ct值為循環(huán)閾值）分析mRNA的相對表達水平。所用引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primers used in real-time PCR

1.2.6 Western blot提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后依次轉(zhuǎn)膜、室溫封閉、孵育一抗（p21、cyclinB1、CDK1為1∶1 000稀釋）4℃過夜、孵育HRP-二抗（1∶5 000稀釋）室溫搖床1 h，洗膜后曝光掃描，以目的蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，作為其相對表達量。

1.2.7 免疫熒光采用爬片：在24孔板中培養(yǎng)DU145細胞，細胞貼壁后加藥刺激24 h，PBS洗滌細胞后4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.5%TritonX-100室溫通透15 min，室溫封閉90 min，一抗孵育（cyclinB1、CDK1分別為1∶400、1∶100稀釋），4℃過夜，熒光二抗（1∶400稀釋）室溫避光孵育1 h，DAPI染色，應用熒光顯微鏡檢測蛋白在細胞中的定位分布。

2 結(jié)果

2.1 GLA抑制DU145細胞增殖各組細胞按相應藥物濃度分別刺激培養(yǎng)1 h、6 h、12 h、24 h、48 h，檢測細胞增殖情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，1 μg/ml GLA對細胞增殖的影響無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；2.5 μg/ml與5 μg/ml GLA能夠抑制細胞增殖，5 μg/ml GLA的抑制效果更為顯著（P<0.01），見圖1。可見GLA抑制DU145細胞增殖的作用呈現(xiàn)劑量依賴效應。

圖1 DU145細胞增殖曲線Fig.1 Proliferation curve of DU145 cells

2.2 GLA阻滯DU145細胞周期與對照組相比，1 μg/ml GLA對細胞周期的影響并無統(tǒng)計學差異。隨著濃度增加，GLA顯現(xiàn)出阻滯細胞周期的作用，當5 μg/ml GLA刺激培養(yǎng)DU145細胞24 h后，細胞周期明顯停滯于G2/M期（P<0.01），見圖2。GLA阻滯DU145細胞周期的作用呈現(xiàn)出明顯劑量依賴效應。

圖2 GLA引發(fā)DU145細胞G2/M期阻滯Fig.2 GLA induces G2/M cell cycle arrest in DU145 cells

2.3 GLA調(diào)節(jié)DU145細胞周期蛋白的表達1 μg/ml GLA刺激培養(yǎng)細胞24 h，與對照組相比，p21、cy‐clinB1、CDK1 mRNA與蛋白的表達均無統(tǒng)計學差異。但隨著濃度的增加，2.5 μg/ml GLA能夠促進p21的表達，并抑制cyclinB1與CDK1的表達；5 μg/ml GLA的作用效果更為明顯，在顯著促進p21表達的同時，更加抑制了cyclinB1與CDK1的表達，且qRTPCR與Western blot的結(jié)果基本一致，見圖3。可見GLA調(diào)節(jié)DU145細胞周期相關(guān)因子的表達，在mRNA與蛋白水平上均表現(xiàn)出劑量效應。

圖3 GLA調(diào)節(jié)DU145細胞周期相關(guān)蛋白的表達Fig.3 GLA regulate cell cycle relative protein expression in DU145 cells

圖5 GLA促進DU145細胞凋亡Fig.5 GLA promote DU145 cells apoptosis

2.4 免疫熒光驗證DU145細胞周期蛋白的定位表達免疫熒光結(jié)果進一步驗證了Western blot的結(jié)果，細胞周期蛋白cyclinB1、CDK1主要表達于細胞質(zhì)，5 μg/ml GLA能夠顯著抑制cyclinB1、CDK1的表達（見圖4）。GLA引起DU145細胞周期阻滯與其抑制cyclinB1、CDK1表達的作用效果及劑量效應完全一致，因此推測GLA極有可能通過抑制cyclinB1、CDK1的表達而導致細胞周期阻滯于G2/M期。

圖4 DU145細胞周期蛋白細胞內(nèi)表達（×400）Fig.4 Localization of cell cycle relative protein in DU145 cells（×400）

2.5 GLA誘導DU145細胞凋亡GLA阻滯細胞周期后極有可能引發(fā)細胞生物學行為發(fā)生變化。流式檢測結(jié)果顯示：2.5 μg/ml GLA作用于細胞，雖然能引起凋亡增加，但與對照組相比并無統(tǒng)計學差異（P>0.05），5 μg/ml GLA才顯 示 出促 凋 亡 效 果（P<0.01）。

3 討論

前列腺癌為常見惡性腫瘤，近年來隨著經(jīng)濟水平的不斷提高，人口老齡化進一步明顯，我國前列腺癌患者呈逐年上升趨勢［5-6］。大多數(shù)前列腺癌發(fā)病隱匿、進程緩慢，就診時往往已是中晚期，臨床多用雄激素治療，但很多患者治療后期出現(xiàn)激素不敏感或耐受，最終腫瘤轉(zhuǎn)移擴散［7］。因此迫切需要尋找抗腫瘤效果明確但不良反應少的藥物。

傳統(tǒng)中草藥一直以其活性強、毒性小備受關(guān)注，其中香茶菜在民間應用歷史悠久［1-4］，已用于臨床的冬凌草就是從香茶菜中提取的活性成分，本研究選取的GLA則是香茶菜的另一種活性成分。前期研究發(fā)現(xiàn)，小劑量GLA能夠通過IL-6激活Stat3信號通路，調(diào)節(jié)細胞炎癥反應，促進腫瘤細胞增殖與侵襲遷移［8-9］。中草藥往往對細胞功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，研究也表明GLA具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用［3-4］。因此，本研究采用較高濃度GLA作用于前列腺癌DU145細胞，探討GLA抗腫瘤的作用機制。

增殖實驗結(jié)果顯示，2.5、5 μg/ml GLA作用于DU145細胞24 h后，可以抑制DU145細胞的增殖，尤以5 μg/ml GLA的作用效果更為顯著。與前期實驗結(jié)果一致的是，與對照組相比，1 μg/ml GLA對細胞增殖的影響作用并無統(tǒng)計學意義。這些結(jié)果均提示GLA抑制細胞增殖的作用呈劑量效應及時間依賴性。增殖與細胞周期關(guān)系密切，周期紊亂可以引起增殖異常。

細胞周期結(jié)果顯示，與對照組相比，1 μg/ml GLA對細胞周期基本無影響。隨著濃度增加，2.5 μg/ml GLA表現(xiàn)出阻滯作用，5 μg/ml GLA的阻滯作用尤為顯著，G2期細胞達44.3%，整體上凸顯G2/M期阻滯。G1期到S期、G2期到M期是復雜活躍的分子水平變化時期，容易受環(huán)境條件影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠抑制DU145細胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而抑制其增殖［10］。本研究結(jié)果提示GLA能夠顯著影響DU145細胞從G2期向M期的轉(zhuǎn)變，進而阻滯細胞周期，抑制其增殖。

參與細胞周期調(diào)控的蛋白主要有S、M、G1期蛋白與CDK激酶。cyclin B為M期周期蛋白，從S期開始表達，在G2/M期到達峰值，后期消失。CDK1的活化依賴于cyclinB1，cyclinB1與CDK1結(jié)合并激活CDK1可以促進細胞由G2期進入M期［11］。p21則是CDK激酶的抑制劑，能夠抑制cyclinB1/CDK的激活，阻滯細胞G2/M期轉(zhuǎn)變［12］。鑒于GLA引發(fā)G2/M期阻滯，因此本研究進一步對p21、cyclinB1、CDK1進行檢測。結(jié)果顯示，5 μg/ml GLA作用DU145細胞24 h，促進p21表達的同時，顯著抑制cyclinB1、CDK1的 表 達。GLA對p21與cyclinB1/CDK1的 作用效果正好相反。與此一致的是，LIN等［13］研究發(fā)現(xiàn)，GLA能夠通過促進/抑制p21、Cdc25C等周期蛋白的表達，阻滯膀胱癌UMUC3的細胞周期。免疫熒光進一步印證了Western blot結(jié)果。與對照組相比，5 μg/ml GLA刺激培養(yǎng)24 h，DU145細胞質(zhì)中cyclinB1與CDK1的表達明顯增多。因此GLA極有可能通過抑制周期蛋白cyclinB1的表達，影響CDK1激酶的活化，進而導致G2/M期阻滯。

細胞周期紊亂會誘發(fā)凋亡，細胞周期長時間停滯也會誘發(fā)凋亡。流式結(jié)果就顯示出5 μg/ml GLA能夠引起DU145細胞凋亡，提示GLA引起周期阻滯的同時，也誘發(fā)了凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)，GLA能夠抑制PI3K/Akt信號通路，導致p21、Bax蛋白累積，繼而激活下游信號通路，引起細胞周期阻滯和凋亡［13-15］。本研究結(jié)果也顯示GLA誘發(fā)G2/M期阻滯與p21蛋白增多相關(guān)，提示GLA極有可能通過p21蛋白信號通路誘導DU145細胞凋亡，具體作用機制在后續(xù)實驗中進一步探索。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GLA能夠誘導DU145細胞周期阻滯于G2/M期，這一作用極有可能是通過抑制細胞周期蛋白cyclinB1、CDK1的表達而誘發(fā)，cyclinB1、CDK1表達升高進一步激活凋亡信號通路，促進細胞凋亡。因而，控制GLA的作用濃度及作用時間，有效發(fā)揮其阻滯細胞周期的作用，對前列腺癌防治有新的意義和價值。