黃連等5種中藥顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星對鮑曼不動桿菌 生物膜的作用研究*

何宇巍，黃穎華，李曉君，譚俊青，黃小玲，王康椿，李藹文

1 廣東省第二中醫(yī)院 廣東廣州 510095

2 中山大學(xué)南方學(xué)院 廣東廣州 510970

鮑曼不動桿菌廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境中，是我國目前院內(nèi)感染常見的病原菌。有報(bào)道顯示[1]，臨床分離的鮑曼不動桿菌生物膜具有非常強(qiáng)的形成率；生物膜一旦形成通過膜內(nèi)細(xì)菌免受或者減少抗生素的侵?jǐn)_等機(jī)制，細(xì)菌就具有了極強(qiáng)的耐藥性和致病性[2-3]。

我們前期實(shí)驗(yàn)表明黃連、黃芩、連翹、烏梅、五味子等五種中藥顆粒劑對鮑曼不動桿菌及其生物膜有不同程度的抑制作用。另一方面左氧氟沙星是臨床上抗鮑曼不動桿菌感染常用的抗生素[4]。而現(xiàn)階段國內(nèi)外對鮑曼不動桿菌生物膜方面的研究主要集中在抗生素方面，中藥及中藥聯(lián)合抗生素對鮑曼不動桿菌生物膜作用的研究及相關(guān)機(jī)制的研究鮮見報(bào)導(dǎo)[5-7]。為進(jìn)一步探討這些單體中藥聯(lián)合抗生素的抑菌機(jī)理，本研究通過篩選有效菌株、建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⑦M(jìn)行體外聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)，觀察黃連等5種中藥顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星對多重耐藥鮑曼不動桿菌（MDRAB）生物膜的抑膜效果，以期為治療MDRAB聯(lián)合用藥提供新的思路，為中藥制劑聯(lián)合抗生素抗菌相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)參考。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株 2019年11月到2020年1月期間在廣東省第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科收集臨床標(biāo)本分離的MDRAB，均為非重復(fù)菌株，共11株。

1.2 藥物及試劑 黃芩（9089261）、黃連（9035861）、連翹（9069171）、烏梅（8071961）、五味子（8031621），這5種中藥顆粒劑均購于廣東一方制藥有限公司；左氧氟沙星氯化鈉注射液（BW05731 第一三共制藥有限公司）；95%乙醇（20181201 廣東省廣寧縣順寧葡萄糖藥業(yè)有限公司）；龍膽紫染色液（419054 珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；無菌鹽水（190921501 廣東怡翔制藥有限公司）；0.45%鹽溶液（3013691）；肉湯培養(yǎng)基（NUB-200302D 廣州市迪景微生物科技有限公司）。

1.3 儀器與材料 VITEK-2型全自動細(xì)菌鑒定及藥敏儀（法國梅里埃）； BSC-1100二級生物安全柜（山東鑫貝）； CX-21生物顯微鏡（OLYMUPS）；海爾冷藏冷凍箱（海爾）；YA28X6T高壓蒸汽滅菌器（寧波甬安）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；電子天平（日本AD）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法與步驟

2.1 用龍膽紫染色法篩選產(chǎn)膜的MDRAB

2.2 用微量倍比稀釋法測定6種單藥最小抑膜濃度

2.3 用棋盤稀釋法測定各聯(lián)合用藥最小抑膜濃度

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3.1 先統(tǒng)計(jì)藥物的最小抑膜濃度；再根據(jù)部分抑菌濃度指數(shù)計(jì)算FIC指數(shù)，當(dāng)FIC指數(shù)小于等于0.5時(shí)，兩種藥為協(xié)同作用；當(dāng)FIC指數(shù)大于0.5且小于等于1時(shí)，兩種藥為相加作用；當(dāng)FIC指數(shù)大于l且小于等于2時(shí)，兩種藥為無關(guān)作用；當(dāng)FIC指數(shù)大于2時(shí)，兩種藥為拮抗作用。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件處理，應(yīng)用Fisher確切概率法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 篩選產(chǎn)生物膜的鮑曼不動桿菌結(jié)果

收集了11株MDRAB，其中10株能產(chǎn)生生物膜，1株不能，產(chǎn)膜率為91%。其中10株產(chǎn)膜MDRAB將用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 6種單藥最小抑膜濃度結(jié)果

五種中藥顆粒劑（黃連、黃芩、連翹、烏梅、五味子）在單獨(dú)作用于MDRAB生物膜時(shí)，對MDRAB生物膜均有一定抑膜作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同藥物的抑膜濃度不同，分別在2～16mg/mL不等，見（表1）；左氧氟沙星作用于MDRAB最小抑膜濃度為16μg/mL，見（表2）；經(jīng)Fisher確切概率法檢驗(yàn)可知，6種藥相對比，不同藥液濃度之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00，P＜0.05）。

表1 各中藥顆粒劑作用于MDRAB最小抑膜濃度分布表

表2 左氧氟沙星作用于MDRAB最小抑膜濃度分布表

3 聯(lián)合用藥FIC作用結(jié)果

五種中藥顆粒劑分別與左氧氟沙星兩兩聯(lián)合用藥的最小抑膜濃度FIC作用結(jié)果顯示：黃連、黃芩、烏梅、五味子四種中藥顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星的FIC表現(xiàn)有協(xié)同、相加作用和無關(guān)作用，未見拮抗作用，其中這四種聯(lián)合作用均以無關(guān)作用為主，占比分別為70%、40%、50%、60%；而連翹聯(lián)合左氧氟沙星的FIC結(jié)果存在協(xié)同、相加和無關(guān)作用，主要表現(xiàn)為拮抗作用，占40%；從以上數(shù)據(jù)可以看出除連翹以外的四種中藥顆粒劑在本次研究中聯(lián)合左氧氟沙星對MDRAB的抑膜作用以無關(guān)作用為主，均可見協(xié)同、相加作用，而連翹聯(lián)合左氧氟沙星對MDRAB的抑膜作用則出現(xiàn)了拮抗的情況，且拮抗占比最高，詳見（表3）。在聯(lián)合用藥效應(yīng)方面，根據(jù)Fisher確切概率法檢驗(yàn)可知5組聯(lián)合用藥之間FIC結(jié)果分布差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.121，P＞0.05），即5組聯(lián)合用藥之間的FIC結(jié)果分布沒有關(guān)聯(lián)性。

表3 聯(lián)合用藥FIC指數(shù)分布表

討 論

由于抗菌藥物的廣泛和不合理應(yīng)用，使細(xì)菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，醫(yī)院由鮑曼不動桿菌引起的感染呈逐年升高的趨勢。而隨著耐藥性的提高，臨床上聯(lián)合用藥的使用也越來越頻繁，許多臨床研究結(jié)果都表明了聯(lián)合用藥的優(yōu)越性，中藥與抗生素的聯(lián)用也為聯(lián)合用藥提供新的思路以及參考依據(jù)[8-9]。

在本研究中，首先利用龍膽紫染色法篩選產(chǎn)生物膜的MDRAB，在臨床分離的11株MDRAB中，其中10株為產(chǎn)生物膜的菌株，產(chǎn)膜率為91%，收集的菌株的生物膜形成率國內(nèi)報(bào)道的結(jié)果相近[1，10-11]；以此10株作為實(shí)驗(yàn)菌株，然后用倍比稀釋法分別測定5種單體中藥對實(shí)驗(yàn)菌株的最小抑膜濃度，結(jié)果顯示五種中藥顆粒劑在單獨(dú)使用時(shí)均對MDRAB生物膜有一定抑膜作用，抑膜濃度從2mg/ml-16mg/ml不等。我們前期研究也表明，該5種中藥顆粒劑對多重耐藥菌有不同程度抑菌作用，通過增加細(xì)菌細(xì)菌膜的通過性等機(jī)制達(dá)到抑菌的效果[12-14]；有研究表明[15]，中藥五倍子水煎劑通過下調(diào)生物膜形成相關(guān)基因bfmS、bfmR、abaI、abaR、BAP的表達(dá)發(fā)揮抑制作用，從而達(dá)到抑制鮑曼不動桿菌生物膜形成的效果。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)藥物對菌株抑膜作用的具體機(jī)制我們也在進(jìn)一步研究中。

在中藥顆粒劑和左氧氟沙星的聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)中，連翹聯(lián)合左氧氟沙星的FIC主要表現(xiàn)為拮抗作用；而根據(jù)岳冬芳[16]，晏奎[17]等人對MDRAB有關(guān)聯(lián)合用藥的研究，磷霉素、頭孢吡肟與左氧氟沙星聯(lián)合使用后的FIC結(jié)果顯示有拮抗作用，據(jù)研究分析，在部分菌株中存在拮抗作用，可能是由于部分菌株存在adeS基因，若使用某些藥物可能會激活adeS基因，使外排泵表達(dá)或者過量表達(dá)，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物就會被泵出，從而表現(xiàn)為拮抗作用[3，18]；在連翹顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星的抑膜研究中出現(xiàn)拮抗作用可能出現(xiàn)了上述相似機(jī)制，從而使其表現(xiàn)拮抗作用。其余四種中藥顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星的FIC主要表現(xiàn)為無關(guān)作用，而協(xié)同、相加也有少量散在分布，其中黃連顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星的無關(guān)作用占比最高，達(dá)70%；表現(xiàn)為無關(guān)作用，可能與聯(lián)合用藥后兩種藥物的活性與單獨(dú)一種抗菌藥物作用相同有關(guān)[19-20]。

由本次聯(lián)合用藥研究結(jié)果可知，連翹在單獨(dú)對MDRAB生物膜作用的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了較差的抑膜效果，且在后續(xù)與左氧氟沙星聯(lián)合用藥的抑膜實(shí)驗(yàn)中，也存在著較高的拮抗作用，在MDRAB抑膜實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)考慮菌株的個(gè)體差異，或者避免使用此聯(lián)用組合；而黃連、黃芩、烏梅、五味子等四種中藥顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星的抑膜實(shí)驗(yàn)中，協(xié)同、相加作用均有出現(xiàn)，以無關(guān)作用為主，不存在拮抗作用；在同類實(shí)驗(yàn)中，可考慮選用這些組合作進(jìn)一步研究。本研究給聯(lián)合用藥提供了新的思路，在細(xì)菌耐藥性越來越嚴(yán)重的今天，面臨著超級細(xì)菌將無藥可用的困境，中藥與抗生素的聯(lián)合使用可能是解決這個(gè)問題新的途徑。