重度中暑豬早期胰島功能的變化

喬澤淵 倪 軍 張 靜 謝國旗

1.新鄉醫學院研究生處，河南新鄉 453000；2.陸軍第八十三集團軍醫院血液內分泌科，河南新鄉 453000

人們在高溫高濕環境作業時極易發生中暑，臨床依據患者的臨床癥狀將中暑分為輕度中暑（先兆中暑）、中度中暑（熱衰竭）、重度中暑（熱射病）[1]。胰島素是重要的糖代謝調節激素，由胰島β 細胞分泌，是體內唯一降血糖的激素，主要在肝臟被胰島素酶滅活，也有少量在腎臟和肌肉中被滅活[2]。重度中暑早期機體需要增加皮膚血流量來散熱，血液從內臟血管網向皮膚血管重新分布，缺血、缺氧加上熱應激，導致胰島、肝、腎組織損傷，影響胰島素穩態[3-5]。重度中暑患者胰島狀態及胰島素的分泌水平對其早期糖代謝有重要影響。本研究通過構建豬重度中暑模型，分析重度中暑豬早期血糖變化特點及其可能機制，以期為臨床重度中暑早期糖代謝干預提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康CV 級雄性巴馬小型豬12 只，體重10～15 kg，購自泰州泰和生物科技有限公司動物實驗中心，動物許可證號：SCXK（蘇）2017-0010。本研究經陸軍第八十三集團軍醫院（以下簡稱“我院”）實驗動物倫理委員會審核批準且遵循實驗動物管理原則。所有實驗動物正常體溫范圍為38～39℃，均抽取血樣進行常規檢測，檢驗結果顯示其血細胞計數、凝血功能、肝腎功能、心肌酶水平均在正常范圍[6-9]。分籠飼養于我院清潔動物實驗室內，室內溫度為（23±1）℃，濕度為（50±5）%，適應性喂養1 周。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸艾司氯胺酮注射液（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：200325BL）；豬胰島素酶聯免疫吸附試驗試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSBE06828p）；豬胰島素免疫組織化學（immuno histo chemistry，IHC）一抗試劑盒（中國Affinity Biosciences公司，貨號：AF5109）；兔二步法二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：PV-6001）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-exosin，HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1120）。恒溫恒濕氣候艙（廣州富宸電器有限公司，型號：改良型F800-Z）；貝克曼生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司，型號：AU5800）；高靈敏度電子體溫計（湖南省瑞博科技有限公司，型號：PM-9000A）；酶標定量測定儀（德國Thermo 公司，型號：Fluoroskan）。

1.3 分組及模型制備

將12 只巴馬小型豬按照隨機數字表法分為對照組與模型組，每組6 只。兩組實驗前禁食、水12 h，實驗前0.5 h 內測量3 次核心溫度，取均值作為基礎體溫。對照組置于室溫下，不做任何處理，模型組連接多參數心電監護儀，待生命體征平穩后，置于預熱的恒溫恒濕氣候艙中，保持在44～47℃，相對濕度（65±5）%。兩組核心溫度由可重復使用的高靈敏熱電偶探頭進行監測，電偶探頭的校準溫度為0～50℃，將電偶探頭置于肛內，每0.5 小時監測一次核心溫度，記錄一般表現，模型組核心溫度＞42℃時終止實驗，采集兩組股靜脈血送檢血糖、胰島素，耳后靜脈注射鹽酸艾司氯胺酮注射液20 mg/kg 進行麻醉后，固定于清潔動物解剖實驗臺，備皮、消毒，無菌操作下逐層打開腹腔，取胰腺、腎、肝組織樣本進行后續檢測。

1.4 觀察指標及檢測方法

股靜脈采血5 ml，用全自動生物化學分析儀檢測兩組血糖水平。另取股靜脈采血5 ml，用恒溫離心機1000 g 離心20 min 取上清液（有效離心半徑10 cm），嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作，計算兩組血液中胰島素水平。無菌操作下取胰腺、肝、腎組織標本，生理鹽水沖洗后立即用10%中性甲醛固定48 h，石蠟包埋后制備組織切片，片厚2.5 μm，HE 染色，光學顯微鏡下觀察其形態改變。

取同一部位胰腺組織用10%中性甲醛固定保存，常規行乙醇脫水、透明、石蠟包埋，切片2.5 μm。經烤片、脫蠟和水化、抗原修復、阻斷、封閉、一抗孵育（一抗按1∶100 比例用含3%非免疫血清的磷酸鹽緩沖液稀釋，4℃孵育過夜，后于37℃孵育1 h 復溫，用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每次5 min）、二抗孵育（滴加二抗，室溫孵育60 min，后磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，每次5 min），顯色，復染，封片后，應用Image-Pro Plus 6.0軟件分析兩組胰島中胰島素的平均光密度值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般情況及核心溫度

模型組進入恒溫恒濕氣候艙后，核心體溫呈升高趨勢，對照組核心溫度無變化，見圖1。模型組核心溫度＞42℃時出現精神萎靡不振，步態不穩，結膜充血，角膜反射減弱或消失，對照組無異常表現。

圖1 兩組核心溫度變化

2.2 兩組實驗前后血糖及血液中胰島素水平比較

實驗前兩組血糖及血液中胰島素水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。對照組實驗前后血糖及血液中胰島素水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。實驗后，模型組血糖水平高于實驗前，血液中胰島素水平低于實驗前，且模型組血糖水平高于對照組，血液中胰島素水平低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 兩組實驗前后血糖及血液中胰島素水平比較（）

表1 兩組實驗前后血糖及血液中胰島素水平比較（）

2.3 兩組胰島、肝、腎組織改變

對照組胰島、肝、腎組織無明顯改變；模型組胰腺組織中胰島邊緣不清，形態不規則，細胞水腫，少量粒細胞浸潤，毛細血管瘀血；腎小管與集合管擴張，血管內可見血栓形成，上皮細胞顆粒變性，少量炎癥細胞浸潤；肝小葉結構紊亂，肝竇輕度瘀血擴張，肝細胞輕度水腫、顆粒變性，見淋巴細胞浸潤。見圖2～4。

圖2 兩組胰腺組織形態（HE，400×）

2.4 兩組胰島中胰島素的表達比較

對照組觀察到數量較多、呈棕黃色的胰島素陽性表達，細胞排列緊密均勻，形態完整；模型組觀察到胰島著色區域少，形態不規則，見圖5（封三）。模型組胰島中胰島素平均光密度值低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖6。

圖3 兩組腎組織形態（HE，200×）

圖4 兩組肝組織形態（HE，400×）

圖5 兩組胰腺組織中胰島素表達（IHC，400×）

圖6 兩組胰島中胰島素水平比較

3 討論

隨著全球氣候變暖，重度中暑患者死亡率可達10%～30%[10]。有研究表明重度中暑患者早期血糖異常升高[11-12]，異常升高的血糖可引起非特異性炎癥反應，導致組織損傷和器官衰竭，影響患者的預后[13-15]。重度中暑導致糖代謝紊亂，可能是由于胰腺、肝臟、腸道、腎臟、肌肉等不同程度的功能和器質損傷，影響了血糖調節的過程，其中胰腺對熱損傷較為敏感[16-17]。有研究觀察到胰腺在中暑時易受缺血、缺氧影響，胰島素分泌功能紊亂[18-19]。

本研究分析和總結國內外近年構建重度中暑實驗動物模型的相關文獻[20-22]，制訂大型動物豬的重度中暑標準如下：①出現明顯的行為異常，如煩躁不安、站立不穩等；②核心溫度＞42℃；③出現生理反射異常，如角膜反射、提肛反射減弱或消失等。本研究將巴馬小型豬置于恒溫恒濕氣候艙（模擬高溫高濕環境）中，當熱暴露時間為4 h 左右時，模型組呼吸、心率加快，出現步態不穩、全身大汗及結膜充血、角膜反射減弱或消失等，測量核心體溫＞42℃，認為造模成功。由于經濟實用易重復，國內多采用大鼠作為實驗動物，但小型動物的體型限制了部分臨床干預手段的實施，而且其生理代謝與人類有較大差異。國外部分學者以狒狒作為實驗動物，但其價格昂貴且不宜獲取，實際操作中難以推廣[23]。小型豬在糖代謝、胰島的發育形態等方面與人類相近，而且溫順、繁殖力強、基因穩定，相較于小型動物大鼠等具有顯著的優勢[24]。

本研究觀察到模型組胰島、肝、腎組織出現一定損傷，免疫組化染色進一步觀察到胰島素染色平均光密度值降低，提示其胰島細胞分泌胰島素功能受損。王超等[25]研究發現熱應激小鼠的血漿胰島素水平降低，認為熱損傷對小鼠糖代謝有一定的抑制作用；李延森等[26]研究觀察到熱應激抑制雄性巴馬香豬胰島素分泌，血糖水平升高；袁雄坤等[27]研究認為母豬中暑早期血糖水平升高，隨著熱應激時間延長，會出現血糖水平降低；劉圈煒等[28]研究認為持續熱應激狀態下，豬血糖水平開始時升高，之后下降，最后又有所升高。以上研究與本研究結果基本一致，提示豬重度中暑早期出現血糖升高，可能不單是胰島素水平的變化，肝腎組織損傷也可能加重了糖代謝紊亂的趨勢，還需要進一步的深入研究。

綜上所述，豬重度中暑早期出現糖代謝紊亂。本研究不足之處在于沒有動態連續觀察豬發生重度中暑后血糖及胰島素水平的變化，實驗結論有一定的局限性，在后續的實驗研究中給予補充完善。