基于IDH 突變相關(guān)代謝基因的膠質(zhì)瘤分型探討

吳陳興 宋洪旺 付曉君 李守巍

1.首都醫(yī)科大學(xué)三博腦科醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100093；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，遼寧沈陽 110004

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，發(fā)病率為22.52/106[1]。70%～80%的較低級別膠質(zhì)瘤發(fā)生異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變，且是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動基因[2-3]。2016 年世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類首次引入IDH 突變作為膠質(zhì)瘤的重要分類指標(biāo)，并明確IDH 突變型（IDH mutant type，IDH-mut）和IDH野生型（IDH wild type，IDH-wt）膠質(zhì)瘤是兩種具有不同生物特征的亞型[4]，IDH-mut 膠質(zhì)瘤具有更好的預(yù)后[5]。IDH 突變的發(fā)現(xiàn)引起了對癌癥代謝的廣泛關(guān)注。

目前IDH-wt 膠質(zhì)瘤預(yù)后差，缺乏有效治療手段。本文通過差異代謝基因聚類將IDH-wt 膠質(zhì)瘤分成三種代謝亞型（C1、C2 和C3 型）。C1 型預(yù)后與IDH 突變型相似；C2、C3 型預(yù)后差。進(jìn)一步利用隨機(jī)森林法篩選C1 型前5 個最顯著特征基因，簡化C1 型診斷模型以增加臨床應(yīng)用的可行性。用此分型精確判斷不同IDH-wt膠質(zhì)瘤預(yù)后，指導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤患者的個體化治療。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

本研究使用2015 年1 月至2020 年1 月來自中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計劃（Chinese glioma genome atlas，CGGA）（http：//www.cgga.org.cn）數(shù)據(jù)庫中294 例患者臨床資料及組織信使RNA（messenger RNA，mRNA）芯片（RNA-array）數(shù)據(jù)，包含IDH 狀態(tài)（IDH-mut/wt）及年齡、性別、組織學(xué)分級及生存預(yù)后情況等[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病年齡≥18 歲；②病理診斷為大腦半球彌漫性膠質(zhì)瘤且符合2016 WHO 分類指南[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①局限性膠質(zhì)瘤；②彌漫中線膠質(zhì)瘤；③小腦或脊髓膠質(zhì)瘤。研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)三博腦科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)，并符合赫爾辛基宣言[7]的原則。

1.2 分析方法

加權(quán)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）旨在尋找共同表達(dá)的基因模塊，并探索基因網(wǎng)絡(luò)和感興趣表型之間的聯(lián)系，在共同表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點與基因相對應(yīng)，連接強(qiáng)度由表達(dá)譜之間的成對相關(guān)性決定。加權(quán)網(wǎng)絡(luò)使用Pearson 相關(guān)矩陣的軟閾值來確定兩個基因之間的連接強(qiáng)度[8]。本研究對CGGA 數(shù)據(jù)庫294 例膠質(zhì)瘤RNA-array 數(shù)據(jù)進(jìn)行WGCNA 分析。相關(guān)矩陣的軟閾值定義為9 次冪，基于生成的連接矩陣，實施拓?fù)渲丿B計算[8]。通過對拓?fù)渲丿B進(jìn)行平均連鎖層次聚類，將具有高度相似表達(dá)的基因分組聚類。進(jìn)一步應(yīng)用動態(tài)混合樹切割算法來切割層次聚類樹，計算基因模塊與IDH-mut/wt 狀態(tài)之間的相關(guān)性。

應(yīng)用WGCNA 篩選與IDH 狀態(tài)相關(guān)基因，對所篩選基因進(jìn)行差異表達(dá)分析得到差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEG）。參照KEGG 代謝通路的基因集（http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp?collection=CP：KEGG），對DEG 中的代謝相關(guān)基因進(jìn)行聚類分析，根據(jù)聚類分析結(jié)果將IDH-wt膠質(zhì)瘤分型。應(yīng)用Kaplan-Meier 生存分析及1 年及3 年生存率驗證新分型意義。應(yīng)用隨機(jī)森林法篩選亞型的特征基因集，簡化診斷模型以增加臨床應(yīng)用的可行性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究使用R 語言（4.0.3 版）、SPSS（21.0 版）軟件和GraphPad Prism（7.0 版）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。WGCNA 檢測應(yīng)用“WGCNA 軟件包”。“ggplots 軟件包”繪制熱圖。使用“random Forest 軟件包”進(jìn)行隨機(jī)森林分析。Log-Rank 檢驗用于分析兩組生存時間估計值差異性。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于IDH-mut/wt 狀態(tài)的代謝基因鑒定

通過WGCNA 從CGGA 數(shù)據(jù)庫的294 例膠質(zhì)瘤RNA-array 數(shù)據(jù)集中識別出10 個與IDH 狀態(tài)（IDHmut/wt）相關(guān)的基因模塊（圖1）。參照KEGG代謝通路的基因集鑒定出42 個代謝相關(guān)差異基因，其中14 個基因表達(dá)水平與IDH-mut 呈正相關(guān)，28 個基因呈負(fù)相關(guān)（P ＜0.05）（圖2）。應(yīng)用這些基因?qū)DH-wt膠質(zhì)瘤進(jìn)行聚類，根據(jù)聚類結(jié)果將IDH-wt 膠質(zhì)瘤分成3 個亞型，分別用C1、C2 和C3 標(biāo)記（圖3）。

圖1 WCGNA 鑒定出10 個與IDH 狀態(tài)相關(guān)的基因模塊

圖2 代謝相關(guān)的差異基因

2.2 新分型的臨床預(yù)后價值

1 年及3 年生存率分析顯示，IDH-mut 膠質(zhì)瘤患者的1 年及3 年生存率分別為65.1%與62.2%，C1 型膠質(zhì)瘤患者1 年及3 年生存率分別為63.2%和60.0%，C2 型膠質(zhì)瘤患者1 年及3 年生存率分別為5.9%和3.0%，C3 型膠質(zhì)瘤患者1 年及3 年生存率分別為17.4%和9.0%。見圖4。

2.3 構(gòu)建隨機(jī)森林模型診斷IDH-wt C1

應(yīng)用42 個差異代謝基因構(gòu)建隨機(jī)森林預(yù)測模型（圖5A）。根據(jù)MDG 值，選擇對分類貢獻(xiàn)最大的前5 位基因（TK1、GPX8、RRM2、NNMT 和GPX7，見圖5B）。應(yīng)用前5 位基因再次構(gòu)建隨機(jī)森林預(yù)測模型。隨機(jī)選擇CGGA 數(shù)據(jù)庫中2/3 數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練組，其他的作為測試組。新模型中TK1、GPX8、RRM2、NNMT 和GPX7的MDG 值分別為13.98、13.94、10.48、10.37 和9.54。訓(xùn)練組的分類準(zhǔn)確度為95.12%，靈敏度為93.75%，特異性為95.60%。OBB 為4.88%。測試組分類準(zhǔn)確度為97.44%，靈敏度為83.33%，特異性為100.00%。

圖5 差異代謝基因構(gòu)建隨機(jī)森林預(yù)測模型

3 討論

腫瘤代謝改變被認(rèn)為是維系腫瘤細(xì)胞形成及生長的“10 大特征”之一[9]。IDH 突變是最常見的代謝酶基因突變類型，為腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的早期分子事件，IDH活性位點突變形成一種新形態(tài)酶，催化α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）轉(zhuǎn)化為R-2-羥戊二酸（R-2-hydroxyglutarate，R-2HG），R-2HG 積累引起基因組廣泛超甲基化，表觀激活癌基因、致癌[10-11]。IDH-wt 膠質(zhì)瘤通常被認(rèn)為惡性程度高、預(yù)后差，且缺乏有效治療手段[12]。但I(xiàn)DH-wt 膠質(zhì)瘤包含多種亞型，“cIMPACTNOW 更新4 提出：具有H3 K27-或H3 G34-突變，MYB/MYBL 改變，BRAF V600 突變等的IDH-wt 彌漫性星形細(xì)胞瘤亞群具有較好的臨床預(yù)后，不應(yīng)列為高度惡性腫瘤[13]。2020 年歐洲神經(jīng)腫瘤協(xié)會（European Association for Neuro-Oncology，EANO）成人彌漫性膠質(zhì)瘤診斷與治療指南明確指出：IDH-wt 膠質(zhì)瘤是一組具有異質(zhì)性的腫瘤，有待通過分子生物學(xué)研究將其中具有IDH-wt 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分子特征的惡性腫瘤和具有生物學(xué)相對惰性生長特性腫瘤（諸如類似兒童彌漫性膠質(zhì)瘤）加以區(qū)分，并進(jìn)行個體化治療[14]。本研究采用WGCNA 方法對CGGA 數(shù)據(jù)庫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析篩選出與IDH 狀態(tài)相關(guān)的代謝基因，并根據(jù)其聚類情況將IDH-wt 膠質(zhì)瘤分為C1、C2 和C3 型。生存分析表明，IDH-wt C2、C3 型的預(yù)后差，IDH-wt C1與IDH-mut 生存率相近。此分型對精確判斷不同IDH-wt 膠質(zhì)瘤預(yù)后具有指導(dǎo)意義。

本研究中經(jīng)差異表達(dá)分析和相關(guān)性分析所取得的代謝基因，在IDH-mut 和IDH-wt 膠質(zhì)瘤中具有顯著表達(dá)差異（圖2），其產(chǎn)物多數(shù)是腫瘤細(xì)胞氨基酸、核苷酸等代謝通路中的關(guān)鍵酶，例如谷氨酸脫氫酶1（glutamate dehydrogenase1，GLUD1）、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1（branched-chain amino acid1，BCAT1）等。理解膠質(zhì)瘤中關(guān)鍵代謝途徑將有助于鑒定更多的治療靶標(biāo)，開發(fā)更有效的治療方法。

IDH-mut 膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過GLUD1 催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為α-KG，促進(jìn)膠質(zhì)瘤祖細(xì)胞的生長[15]。本研究中IDH-mut 膠質(zhì)瘤GLUD1 的表達(dá)水平明顯高于IDH-wt 膠質(zhì)瘤，GLUD1 表達(dá)和IDH-mut 致癌驅(qū)動機(jī)制相關(guān)，谷氨酸代謝是膠質(zhì)瘤潛在治療靶點。BCAT1 是支鏈氨基酸分解代謝的酶，BCAT1 高表達(dá)是IDH-wt 膠質(zhì)瘤的特征。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中BCAT1 的減少可阻止谷氨酸的分泌，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲性降低[16-17]。BCAT1 在膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制中起重要作用，BCAT1 及支鏈氨基酸代謝成為IDH-wt 膠質(zhì)瘤患者的治療靶點。還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）作為谷胱甘肽（glutathione，GSH）還原酶的輔酶，促進(jìn)細(xì)胞抗氧化[18]。在IDH-mut膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，NADPH 缺乏，電離輻射、活性氧造成DNA 雙鏈斷裂增加，這是IDH-mut 膠質(zhì)瘤對放化療敏感的原因之一[19]。谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基是GSH 合成的限速酶；谷胱甘肽過氧化物酶7/8 是GSH 過氧化物酶家族的成員，催化GSH 還原氫過氧化物，是生物體內(nèi)重要的氧自由基清除劑[20]。GSH 的代謝脆性可能是提高IDH-mut 膠質(zhì)瘤對放療和化療敏感性的潛在治療靶點[21]。

脫氧胞苷酸脫氨酶（deoxycytidylate deaminase，DCTD）基因編碼的蛋白質(zhì)催化脫氧胞苷一磷酸脫氨為脫氧尿苷酸，而脫氧尿苷酸是胸苷酸合成酶（thymidine synthase，TYMS）的核苷酸底物[22]。TYMS 在DNA 生物合成的早期階段起著至關(guān)重要的作用，并已成為抗代謝制劑5-氟尿嘧啶和培美曲塞化療的重要靶標(biāo)[23]。吉西他濱為DCTD 的抑制劑，吉西他濱及其代謝物二氟-脫氧尿苷具放療增敏作用，并具有良好的血-腫瘤屏障通過率，與放療聯(lián)用于IDH-wt 膠質(zhì)瘤具潛在治療效果[24-25]。

本研究進(jìn)一步利用隨機(jī)森林法篩選C1 型前5 個最顯著特征基因（TK1、GPX8、RRM2、NNMT 和GPX7），其表達(dá)水平可用于IDH-wt C1 型診斷，診斷準(zhǔn)確度為95.12%，敏感性為93.75%，特異性為95.60%，簡化C1型診斷模型以增加臨床應(yīng)用的可行性。一方面，準(zhǔn)確的預(yù)后預(yù)測可以指導(dǎo)針對IDH-wt 膠質(zhì)瘤的更合理的隨訪和更積極的治療方案的制訂；另一方面，針對IDH-wt C1 組與C2、C3 組之間的代謝差異可進(jìn)行針對性代謝缺陷靶向治療。本研究尚局限于生信分析層面，應(yīng)進(jìn)一步完善蛋白質(zhì)水平研究，以闡明蛋白質(zhì)水平各種代謝酶活性的差異，且需要進(jìn)一步的研究來解釋這種表觀遺傳差異。