長鏈非編碼RNA FAL1 對胃癌細胞增殖和凋亡能力的影響及機制研究

曹獻馗 謝 斌 邵 旸 林 杰

遼寧省腫瘤醫院普外科，遼寧沈陽 110042

胃癌（gastric cancer，GC）是常見的消化道腫瘤[1]，患者早期無明顯癥狀[2]，導致診斷延遲，轉移率高[3]，尋找有效的靶點對治療GC 至關重要[4]。GC 的發生發展與基因調控網絡的失衡密切相關[5]，人類基因組中存在大量的非編碼蛋白質的RNA[6]。其中，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）參與轉錄調控和染色質修飾等生理過程，在腫瘤發生中具有重要作用[7]，與腫瘤的發展密切相關[8-9]。本研究顯示lncRNA FAL1 在GC 細胞中過表達，參與腫瘤增殖和凋亡。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 細胞培養及轉染

人胃腺癌細胞株SGC-7901、BGC-823 及正常胃黏膜細胞GES-1 取自遼寧省腫瘤醫院中心實驗室。所有細胞系均在含10%胎牛血清（Hyclone，通用生命科學，美國）DMEM 培養基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，sigma，美國）中培養，另加100 U/ml 鏈霉素和100 U/ml 青霉素（Thermo Fisher Scientific，美國）。培養條件為37℃，5%CO2。設計并合成了2 種以FAL1為靶點的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA；genechem，中國），分別為si-FAL1#1 組及si-FAL1#2組。構建STAT3 過表達pcDNA3.1 質粒（Invitrogen，美國）。細胞接種于六孔板，密度1.8×105/孔，并置于37℃培養條件24 h。細胞于含10%胎牛血清、不含抗生素的DMEM 中培養基轉染相應載體48 h。收集細胞進行相關實驗。

1.2 RT-PCR

TRIzol 法提取樣本總RNA，檢測純度及濃度。逆轉錄和PCR 反應均嚴格按照TAKARA 公司說明書進行，以U6 作為內參進行相對定量，每組設3 個復孔，ROCHE 實時定量熒光PCR 儀進行檢測。FAL1 的正向引物序列：5’-CCTGGCCAAGAAGCTCATAG-3’，反向引物序列：5’-TGAGGACACCGACTACTGAGAA-3’；STAT3 的正向引物序列：5’-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3’，反向引物序列：5’-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3’；U6 的正向引物序列：5’-TTATGGGTCAGGCAGAAGCAGAGGTAGCTAGCCTGAC-3’，反向引物序列：5’-CACTATTGCGGGCTGC-3’。采用2-△△Ct法計算兩者的相對表達量。△Ct=Ctmarker-CtU6。PCR 條件：95℃，5 min；95℃，30 s；8℃，30 s；72℃，45 s；32 個循環，72℃，10 min。

1.3 Western blot

提取總蛋白，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE；Beyotime，中國）。隨后，轉移到硝基纖維素膜（Millipore，美國）。室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后與STAT3（1∶1000，Proteintech，美國）和β-actin（1∶5000，Proteintech，美國）孵育過夜。膜洗滌3 次，二抗（1∶5000，Proteintech，USA）室溫孵育1 h，顯影成像，ImageJ 分條帶灰度值。

1.4 CCK-8

依據CCK-8 系統（Dojindo，日本）測定細胞活力。細胞接種在96 孔板中（每孔1×104個細胞）。細胞于37℃黑暗孵育，于培養0、24、48、72 h 每孔加入10 μl CCK-8 溶液，再孵育4 h。然后使用酶標儀（Tecan，瑞士）在450 nm 處評估每個孔的吸光度。

1.5 Annexin V-FITC PI 雙染色檢測細胞凋亡

細胞處理后，用4℃PBS 對細胞進行胰蛋白酶化和洗滌。根據操作手冊，使用Annexin V/PI 檢測試劑盒（Molecular Probes Inc.Eugene，OR）在黑暗中孵育細胞懸液15 min。流式細胞術檢測細胞凋亡（Beckman Coulter，USA），實驗重復3 次。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，采用t 檢驗或方差分析。計數資料以例數表示。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FAL1、STAT3 在GC 細胞及胃黏膜上皮細胞中表達情況

RT-PCR 顯示，FAL1 在人胃腺癌細胞株SGC-7901和BGC-823 中RNA 的表達高于胃黏膜細胞GES-1中表達，差異有統計學意義（P ＜0.05），見圖1A。RTPCR 和Western blot 顯 示，STAT3 在SGC-7901 和BGC-823 中mRNA 表示高于GES-1，差異有統計學意義（P ＜0.05），見圖1B～C。

圖1 FAL1、STAT3 在GC 細胞及胃黏膜上皮細胞中表達情況

2.2 下調FAL1 對STAT3 表達的影響

RT-PCR 顯示，轉染后GC 細胞中FAL1 表達量降低（P ＜0.05），見圖2A。胃癌細胞中STAT3 的表達同樣下降（P ＜0.05），見圖2B。其中第2 條序列（si-FAL1#2）具有更好的沉默效果，用于后續表型實驗。

圖2 下調FAL1 對STAT3 表達的影響

2.3 FAL1、STAT3 對GC 細胞增殖能力的影響

將si-FAL1#2 序列轉染SGC-7901 和BGC-823細胞后，細胞增殖減緩。在此基礎上過表達STAT3，被抑制的細胞的增殖能力部分恢復（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 FAL1 和STAT3 對GC 細胞增殖能力的影響

2.4 FAL1、STAT3 對GC 細胞凋亡能力的影響

將si-FAL1#2 轉 染SGC-7901 和BGC-823 細胞，細胞早期凋亡明顯增加，過表達STAT3 后，凋亡細胞降低（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 FAL1 和STAT3 對GC 細胞凋亡能力的影響

3 討論

闡明胃癌進展的遺傳和表觀遺傳學機制是研究重點，但其機制仍未明確[10-11]。LncRNAs 作為轉錄組的重要組成部分，根據其位置及轉錄方式可分為：反義，內含子，重疊，長鏈基因間lncRNA，頭對頭及eRNA等多種類型[12]。lncRNA 在不同腫瘤中異常表達[13-14]，通過表觀遺傳修飾、轉錄調控及轉錄后修飾，調控腫瘤相關基因表達，參與腫瘤發生發展[15-16]。報道顯示lncRNA 作為抗乳腺癌治療腫瘤的靶點，具有一定的臨床價值[17]。血液中游離的lncRNA 是肺癌診斷的分子標志物[18]。lncRNAs 在GC 中也存在異常表達：Zhang等[19]對GC 患者組織及正常組織中LncRNA 進行了篩選，發現TINCR、CCAT2、AOC4P、BANCR、LINC00857等在GC 中表達上調。Wang 等[20]發現LncRNA UCA1通過促進Cbl-c 介導的GRK2 泛素化調節GRK2 蛋白的穩定性，提高GC 細胞的轉移能力。

FAL1 是一條新發現的lncRNA，在腫瘤中發揮重要的功能：FAL1 在骨肉瘤組織和細胞中高表達，同腫瘤的轉移、分期和生存率密切相關，下調FAL1 可以抑制骨肉瘤的增殖、侵襲、遷移和上皮-間質轉化，從而抑制骨肉瘤的進展[21]。FAL1 可與PRC1 的BMI1 亞基結合，抑制靶基因p21 的啟動子，導致細胞周期失衡，加速卵巢癌進展[22]。FAL1 作為“海綿”，與miR-1236 結合促進細胞增殖和轉移[23]。然而，FAL1 在胃癌中的作用尚不清楚。

STAT3 參與AK/STAT 通路的激活，該通路廣泛參與細胞增殖、遷移和侵襲[24]。Wu 等[25]研究發現腫瘤相關成纖維細胞分泌IL-6，激活GC 細胞的JAK2/STAT3 信號通路，促進GC 細胞的遷移和上皮間質轉化。本研究發現，在抑制FAL1 的表達后，STAT3 的mRNA 和蛋白表達均下降。而且在下調FAL1 的表達后，細胞增殖能力下降，凋亡增加；在此基礎上過表達STAT3，被削弱的惡性表型恢復，這提示FAL1 在GC中的促癌作用是通過STAT3 實現的。

綜述所述，lncRNA FAL1 和STAT3 協同作用，促進GC 的惡性增殖，并抑制細胞凋亡，后續將在在體模型中對此進行驗證，并探討STAT3 在GC 中的下游調控機制。