PCPA失眠大鼠不同時(shí)間皮質(zhì)前額葉ATP水平變化及酸棗仁湯的干預(yù)作用*

武 靜，王 慧，史 琴，藏印竹

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院：1.解剖教研室；2.功能實(shí)驗(yàn)室；3.生理教研室；4.研究生學(xué)院 550002)

論著·基礎(chǔ)研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.04.003

PCPA失眠大鼠不同時(shí)間皮質(zhì)前額葉ATP水平變化及酸棗仁湯的干預(yù)作用*

武 靜1，王 慧2△，史 琴3，藏印竹4

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院：1.解剖教研室；2.功能實(shí)驗(yàn)室；3.生理教研室；4.研究生學(xué)院 550002)

[摘要] 目的 研究氯苯丙氨酸(PCPA)誘導(dǎo)的失眠大鼠前額皮質(zhì)三磷酸腺苷(ATP) 不同時(shí)間水平變化情況，探討酸棗仁湯(SZRD)的干預(yù)機(jī)制。方法 大鼠分為正常對(duì)照組(不做任何操作)，SZRD對(duì)照組(第1、2、3天腹腔注射蒸餾水，第4～10天蒸餾水灌胃)，空白對(duì)照組，模型組，SZRD治療組，五羥色氨酸(5-HTP)組，5-HTP+SZRD組。采用連續(xù)3 d腹腔注射PCPA的方法建立大鼠失眠模型，各組在實(shí)驗(yàn)的第4、5、6、8、10天分別取大鼠前額葉皮質(zhì)，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)各組大鼠不同時(shí)間前額皮質(zhì)ATP水平。結(jié)果 模型組大鼠實(shí)驗(yàn)第4、5、6、8、10天ATP水平顯著下降，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；SZRD治療組第4、5、6、8、10天ATP水平較模型組逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；SZRD對(duì)照組前額葉皮質(zhì)ATP水平與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；空白對(duì)照組和正常對(duì)照組比較，前額皮質(zhì)ATP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；5-HTP組與SZRD對(duì)照組、5-HTP+SZRD組之間比較差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 SZRD與5-HTP本身對(duì)正常大鼠前額皮質(zhì)ATP水平變化無(wú)顯著影響，SZRD對(duì)前額皮質(zhì)ATP的作用出現(xiàn)在PCPA所致失眠后。

腺苷三磷酸；芬克洛寧；入睡和睡眠障礙；酸棗仁湯；前額葉皮質(zhì)

[Abstract] Objective The study is intended to examine changes in prefrontal cortex ATP concentrations over time in PCPA induced insomnia rats,and to examine the intervention effects of Suanzaoren decoction.Methods SD rats randomly assigned to normal control,control,model,SZRD control,SZRD treatment,5-HTP,and 5-HTP + SZRD groups.PCPA was injected intraperitoneally over three days to induce the insomnia model.One day after induction,at the fourth,fifth,sixth,eighth,and tenth days after experiment,subjects from each group were examined for prefrontal cortex ATP concentration using the HPLC method.Results Prefrontal cortex ATP concentrations in the PCPA Model group at the fourth,fifth,sixth,eighth,and tenth days were declined significantly compared with the Control group (P<0.01).Compared with the PCPA Model group,the SZRD treatment group showed significant (P<0.05) increase at the fourth,fifth,sixth,and eighth days after assay,and a significant increase (P<0.01) on the tenth day.A comparison of the Control group with the Normal control group,and a comparison among the SZRD control group,the 5-HTP,and 5-HTP+SZRD groups showed no significant differences in prefrontal cortex ATP concentrations.Conclusion SZRD with 5-HTP itself has no significant effect on normal rats prefrontal cortex ATP levels,SZRD role of the prefrontal cortex appear to the ATP after PCPA caused insomnia.

酸棗仁湯(cuanzaoren decoction,SZRD)作為治療失眠癥的經(jīng)典方劑療效確切，被歷代醫(yī)家推崇。筆者前期的研究表明，PCPA所致失眠大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被激活，SZRD對(duì)激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有一定的調(diào)節(jié)作用[1]。研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能分泌ATP等物質(zhì)調(diào)節(jié)多種神經(jīng)功能活動(dòng)[2]，有研究發(fā)現(xiàn)睡眠活動(dòng)與腦內(nèi)ATP的水平有密切關(guān)系[3]，腦內(nèi)ATP在氯苯丙氨酸(PCPA)失眠大鼠發(fā)展過(guò)程中是如何變化的，其在失眠的不同時(shí)間段表現(xiàn)又如何？是值得研究的問(wèn)題。本研究以PCPA失眠模型大鼠為對(duì)象，利用高效液相色譜(HPLC)法連續(xù)檢測(cè)PCPA失眠后第4、5、6、8和第10天大腦皮質(zhì)ATP動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，探討皮質(zhì)ATP在PCPA失眠過(guò)程中的作用及其變化規(guī)律，同時(shí)觀察SZRD的干預(yù)作用，以期進(jìn)一步探討SZRD治療失眠的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年清潔級(jí)SD雄性大鼠245只，體質(zhì)量200～220 g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：[SCXK(渝)2012-000J]。置于安靜、溫度保持恒定(22±2)℃、避免強(qiáng)光的環(huán)境中飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 儀器 LC-10AT高效液相色譜儀、SPD-10A紫外檢測(cè)器(日本島津公司)；Milli-pore 0.22 μm濾膜和過(guò)濾器(美國(guó)Milli-pore公司)；AUM220D電子分析天平(日本Shimadzu公司)；低溫離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)。

1.1.3 試劑和藥物 磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、高氯酸、丙二醇均為市售分析純，購(gòu)自武漢華創(chuàng)化工有限公司；PCPA(批號(hào)1001685258)、5-羥色氨酸(5-HTP，批號(hào)101399644)購(gòu)自Sigma公司。酸棗仁、川芎、知母、茯苓、甘草均購(gòu)自貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 SZRD:由酸棗仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川芎5 g，甘草3 g組成，稱(chēng)取以上5味藥材10付，共計(jì)460 g，加10倍量水，浸泡1 h后煎煮，煮沸后30 min濾過(guò)，藥渣加5倍量水煎煮，煮沸后20 min濾過(guò)，合并濾液，濃縮成150%的水提物，分裝滅菌，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物分組與模型制備 SD成年大鼠245只，分為以下7個(gè)大組(每個(gè)大組35只大鼠，每個(gè)大組又在實(shí)驗(yàn)的第4、5、6、8、10天各分為一個(gè)亞組，共5個(gè)亞組，每個(gè)亞組7只大鼠):空白對(duì)照組、模型組、SZRD治療組、5-HTP組、5-HTP+SZRD組、SZRD對(duì)照組、正常對(duì)照組。根據(jù)以往的實(shí)驗(yàn)方法并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制作PCPA失眠模型大鼠，具體方法為：按350 mg/kg以10 mL/kg體積腹腔注射PCPA，于每天上午8:00～9:00進(jìn)行，每天1次，持續(xù)3 d。

1.2.3 給藥方法 空白對(duì)照組第1、2、3天腹腔注射蒸餾水，第4～10天蒸餾水灌胃；模型組組第1、2、3天腹腔注射PCPA(350 mg/kg)，第4～10天蒸餾水灌胃；5-HTP組第1、2、3天腹腔注射5-HTP(25 g/kg)，第4～10天蒸餾水灌胃；SZRD治療組第1、2、3天腹腔注射PCPA，第4～10天SZRD(濃度為15 g/kg，即含生藥1.5 g/mL)灌胃；5-HTP+SZRD組第1、2、3天腹腔注5-HTP(25 g/kg)，第4～10天SZRD(10 mL/kg)灌胃；SZRD對(duì)照組第1、2、3天腹腔注射蒸餾水，第4～10天SZRD灌胃；正常對(duì)照組不進(jìn)行任何操作。

1.2.4 取材 各組在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的第4、5、6、8、10天分別取材，取材方法如下：末次給藥后2 h，40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠，冰上快速取出大鼠腦組織，去掉嗅球、小腦及低位腦干，取大腦皮質(zhì)放入液氮，移至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCPA失眠后不同時(shí)間前額葉皮質(zhì) ATP水平檢測(cè)方法

1.3.1 ATP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 精密稱(chēng)取ATP標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品10.00 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻，即得1.00 mg/mL的ATP標(biāo)準(zhǔn)液，置于4 ℃冰箱避光保存。

1.3.2 HPLC法檢測(cè)PCPA給藥后不同時(shí)間前額葉皮質(zhì)ATP水平 (1)色譜條件∶色譜柱，Phenomemex C18(4.6×150 mm,5 μm);流動(dòng)相比例號(hào)甲醇-磷酸鹽緩沖液=2∶98(V/V)；流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。(2)樣品前處理:精密稱(chēng)取大腦前額葉皮質(zhì)組織0.1 g加入0.4 mol/L高氯酸 1.0 mL，冰上研磨1 min，低溫高速離心10 min(4 ℃，11 200 r/min)，取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜即成測(cè)定樣品。(3)定性分析:將ATP標(biāo)準(zhǔn)液在色譜儀上以20 μL進(jìn)樣作色譜分析。在標(biāo)準(zhǔn)液的定性分析中，根據(jù)保留時(shí)間及紫外譜圖判定該物質(zhì)。ATP標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間是4.598 min。(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備:在選定的色譜條件下，按外標(biāo)定量法，配制ATP質(zhì)量濃度分別為：0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL，取20 μL，依次進(jìn)樣，以ATP的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C，μg/mL) 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=1E+06X+98548(R2=0.998 7)。(5)樣品水平測(cè)定:依前法檢測(cè)各組標(biāo)本。

2 結(jié) 果

2.1 模型制備結(jié)果 模型組大鼠腹腔注射PCPA 3 d造成失眠后，第4天ATP水平下降，在PCPA失眠第5、6、8、10天ATP水平均處于較低水平，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 SZRD對(duì)失眠眼大鼠前額葉皮質(zhì)ATP水平的影響。

2.2.1 SZRD治療組與模型組比較 SZRD治療組PCPA失眠第4天ATP水平較低，但在PCPA失眠第5、6、8、10天ATP水平逐漸上升，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2.2 SZRD對(duì)照組與空白對(duì)照組比較 從實(shí)驗(yàn)第4～10天前額葉皮質(zhì)ATP水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示SZRD本身不能引起大腦皮質(zhì)ATP水平變化。

2.2.3 正常對(duì)照組與空白對(duì)照組比較 從實(shí)驗(yàn)第4～10天前額葉皮質(zhì)ATP水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明腹腔注射與灌胃等手術(shù)操作對(duì)大腦皮質(zhì)前額皮質(zhì)ATP水平變化無(wú)明顯影響。

表1 各組大鼠不同時(shí)間前額皮質(zhì)ATP水平

a:P<0.01，與空白對(duì)照組比較；b:P<0.05，c:P<0.01，與模型組比較。

3 討 論

ATP是體內(nèi)的能量貨幣單位，能夠維持腦細(xì)胞正常的生理功能[4]。近年來(lái)，ATP被認(rèn)為是一種神經(jīng)遞質(zhì)[5]，能調(diào)節(jié)興奮性和抑制性的神經(jīng)信息傳遞，它可作為神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)神經(jīng)元之間和神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間信號(hào)傳遞[6]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠ATP含量在基底前腦、皮質(zhì)扣帶回及額葉覺(jué)醒時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定，但在睡眠開(kāi)始的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)ATP的量大量上升，與心電圖(EEG)的慢波形成對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明睡眠活動(dòng)與腦內(nèi)ATP水平有密切關(guān)系[7]。

PCPA失眠模型是通過(guò)PCPA阻斷腦內(nèi)5-HT的合成，造成動(dòng)物失眠，是目前國(guó)內(nèi)外較為公認(rèn)的失眠模型[8-9]。PCPA(350 mg/kg)連續(xù)3 d對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，大鼠逐漸飲水增多、飲食增加、明顯活躍，對(duì)外界刺激較敏感，睡眠晝夜節(jié)律消失，提示復(fù)制失眠大鼠成功。

本研究結(jié)果表明，PCPA能導(dǎo)致大鼠前額皮質(zhì)ATP水平下降，從失眠第4天至第10天ATP水平仍處于低水平。SZRD治療組前額皮質(zhì)ATP從失眠第5天開(kāi)始至第10天水平增加，表明SZRD能增加PCPA失眠大鼠前額皮質(zhì)的ATP水平。

有研究表明PCPA能夠影響腦內(nèi)前額皮質(zhì)神經(jīng)元功能，PCPA失眠3 d后線(xiàn)粒體開(kāi)始腫脹，逐漸空泡化[10]。本課題組前期研究結(jié)果表明PCPA失眠大鼠大腦皮質(zhì)中ATP酶活性發(fā)生變化[11]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)、外離子分布失衡，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞興奮性變化。胡曉輝等[12]也證實(shí)PCPA失眠大鼠中縫背核galanin神經(jīng)元發(fā)生變化，影響腦內(nèi)的能量代謝過(guò)程。

本研究前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SZRD可作用于PCPA失眠大鼠腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞[1]，目前已知腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞能釋放ATP作為膠質(zhì)遞質(zhì),星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)胞內(nèi)鈣離子依賴(lài)釋放ATP[13]，影響神經(jīng)元的生物學(xué)活動(dòng)[14]。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究推測(cè)SZRD可能作用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能而改變腦內(nèi)ATP的水平。本研究還發(fā)現(xiàn)，SZRD不改變正常大鼠前額皮質(zhì)的ATP水平，在未失眠大鼠，SZRD與5-HTP也無(wú)協(xié)同作用，灌胃與腹腔注射及手術(shù)操作也未顯著影響前額皮質(zhì)ATP水平，5-HTP組、5-HTP+SZRD組及SZRD對(duì)照組從實(shí)驗(yàn)第4～10天，前額葉皮質(zhì)ATP水平與模型組相比處于較高水平，進(jìn)一步證明PCPA失眠能導(dǎo)致前額葉皮質(zhì)ATP水平下降。本研究提示，SZRD對(duì)大腦皮質(zhì)ATP的作用只發(fā)生在PCPA所致失眠后，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

SZRD是《金匱要略》中治療失眠的經(jīng)典方劑，療效確切，至今臨床仍廣泛應(yīng)用，SZRD對(duì)前額皮質(zhì)ATP作用可能是其發(fā)揮治療睡眠障礙的環(huán)節(jié)之一，本實(shí)驗(yàn)為SZRD治療失眠的機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Changes in prefrontal cortex ATP concentration over time after PCPA induced insomnia and the intervention effect of Suanzaoren decoction*

WuJing1,WangHui2△,ShiQin3,ZangYingzhu4

(1.DepartmentofAnatomy;2.FunctionalLaboratory;3.DepartmentofPhysiology;4.GraduatSchool,GuiyangCollegeofTCM,Guizhou,Guiyang550025,China)

adenosine triphosphate;fenclonine;sleep initiation and maintenance disorders;insomnia;prefrontal cortex

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360590)。 作者簡(jiǎn)介：武靜(1981-)，碩士，講師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。△

，E-mail:wanghsky@126.com。

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1671-8348(2017)04-0439-03

2016-09-10

2016-10-18)