毛竹內生拮抗細菌篩選及其16S rDNA鑒定

摘 要：通過平板對峙法、濾紙片法、牛津杯法對6種食用菌病原菌的拮抗效果進行了初篩和復篩，并觀察了細菌菌落表征性狀;進行了16S rDNA序列分析。結果表明，初步篩選出了JL-B16、JL-A07、JL-B05、JL-B11、CT-B19、CT-B01、CT-B04-1、CT-A16等8株具有初步拮抗效果的內生細菌;復篩出4株具有較好拮抗效果的內生細菌，菌株編號分別是JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07;4株內生拮抗細菌菌株分屬于2屬3種，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）和短桿菌屬（Brevibacterium）。該研究為內生拮抗細菌開發、防病微生物菌劑的制備及應用提供了資源。

關鍵詞：毛竹;內生拮抗細菌;食用菌病原菌;篩選

中圖分類號 S763 ? ?文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2021）17-0034-05

Screening of Endophytic Antagonistic Bacteria in Phyllostachys edulis and Identification of 16S rDNA

YUAN Zongsheng

（Institute of Oceanography， Minjiang University， Fuzhou 350108， China）

Abstract： 82 endophytic strains of Phyllostachys edulis were screened and re-screened by plate-contrast， paper-filtered and oxford cup method. Through the preliminary screening of six edible fungus pathogens by plate-contrast method， 8 strains of JL-B16， JL-A07， JL-B05， JL-B11， CT-B19， CT-B01， CT-B04-1， CT-A16 were screened out. In addition， eight strains of endophytic bacteria were screened by the treatment methods of paper-filtered method and Oxford cup method. 4 strains of endophytic bacteria with good antagonistic effect on 6 kinds of edible fungus pathogens were selected. The strain numbers were JL-B05， JL-B16， CT-A16， JL-A07， The 4 strains of endophytic antagonistic bacteria were classified as Bacillus and Brevibacterium respectively. This study provides a basis for the development of endogenous antagonistic bacteria and provides resources for the preparation and application of antimicrobial agents.

Key words： Phyllostachys edulis; Endophytic Antagonistic Bacteria; Pathogens of Edible Fungi; Screening

植物內生細菌指其生活史的一定階段或全部階段均生活在健康植物的各種組織和器官內部， 并且與植物建立了和諧聯合關系的細菌[1]。植物內生細菌因其生態學優勢，能在植物體內長期定殖、傳導，且不易受環境條件的影響，內生細菌通過自身產生代謝產物或借助信號轉導對宿主植物生長發育產生重要影響，促進宿主植物生長發育、增強宿主植物抗性抵抗疾病以及不良環境及提高植物修復能力，是非常難得的天然生物資源[2-7]，在農業生產中具有良好的研究和開發潛力。例如，Microbacterium具有促進植物生長的作用[8]，Bacillus具有良好的生防潛力[9]，Sphingomonas對植物有自我修復功能[10]等。內生菌對植物病害的防病機理主要是通過4個方面：一是產生抗生素類物質，在低濃度下可以對微生物產生影響[11];二是產生水解酶，可降解某些致病因子[12];三是產生生長調節劑[13]，內生菌也可以產生植物生物激素類物質促進植物生長;四是內生菌與病原菌競爭營養物質，使病原菌得不到必要的營養供給而死亡以及增強宿主植物的抵抗力以及誘導植物產生系統抗性等途徑抑制病原菌的生長[14]。因此，對具有防病等功能內生細菌資源的研究具有重大意義。

本研究選取從福建省3個毛竹中心產區[15] I度毛竹的根、鞭、桿、葉部組織分離的82株可培養內生細菌[16-17]，研究內生細菌對主要食用菌病害的拮抗作用，并篩選出具有較強拮抗效果的內生細菌菌株，為拮抗內生細菌資源的合理開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1.1.1 內生細菌 82株毛竹內生細菌，分別從福建省武夷山（武夷山市星村鎮）、將樂（將樂縣龍棲山自然保護區）、長汀（長汀縣四都鎮）3個毛竹中心產區的I度毛竹根、鞭、桿和葉等組織中分離取得，并保存于福建農林大學菌物研究中心。

1.1.2 食用菌病原菌 （1）油疤病菌（Scytalidium lignicola）;（2）蛛網病菌（Cladobotryum semicirculare）;（3）粘菌病菌（Comatrichapulchell（C.Bab）Rost sp.）;（4）綠色木霉（Trichoderma pleuroticola）;（5）青霉（Penicillium cyclopium）;（6）黃色霉菌（Disporotrichum dimorphosporum）。

1.2 培養基及主要試劑 內生細菌培養采用NA培養基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，Nacl 5g，瓊脂18g，水1000mL，pH7.0～7.2;12l℃滅菌30min（液體培養基不加瓊脂）。病原菌培養采用PDA培養基：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，pH自然;12l℃滅菌30min。瓊脂培養基：瓊脂粉20g，蒸餾水1000mL，pH自然;12l℃滅菌30min。

內生細菌DNA提取、16S rDNA片段擴增所用的引物、Marker、dNTPs、Buffer、溶菌酶等試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司產品，其余試劑均為國產分析純。

1.3 內生拮抗細菌的初篩 選取已分離純化的內生細菌，通過平板對峙法對6種食用菌病原菌（油疤病菌、蛛網病菌、粘菌病菌、綠色木霉、青霉、黃色霉菌）進行對峙培養，篩選具有較好拮抗作用的內生細菌。

平板對峙法：將溶化好的PDA培養基冷卻到55℃左右，倒平板，平板冷凝后，在平板中央接入病原菌瓊脂塊，在距中央2.0～2.5cm處接入內生細菌菌株，以單獨接種病原菌瓊脂塊為對照，然后將平板置于培養箱28℃培養，每個處理3次重復，觀察有無抑菌圈并判定拮抗作用的強弱。

拮抗作用強弱的判定：“+++”表示強抑菌效果，內生細菌菌落周圍有明顯的抑菌圈;“++”表示中等抑菌效果，內生細菌菌落周圍有抑菌圈，細菌與病原菌或食用菌對峙生長，病原菌不能覆蓋內生細菌菌落繼續生長;“+”表示較弱抑菌效果，但病原菌或食用菌能覆蓋細菌菌落繼續生長;“-”表示無抑菌效果;內生細菌對病原菌或食用菌的生長無任何影響。

1.4 內生拮抗細菌的復篩 選取平板初篩過程中對食用菌病原菌具有拮抗效果的內生細菌，通過平板對峙法、濾紙片法、牛津杯法對食用菌病原菌的拮抗效果進行復篩。

將平板初篩過程中具有一定拮抗效果的內生細菌接種于裝液量為100mL的NA液體培養基的250mL三角瓶中，每個處理3次重復。在28℃，180r/min的條件下培養72h，通過離心（4℃，10000r/min，15min）取得上清液，經0.22μm微孔濾膜過濾后將所得濾液用于濾紙片法和牛津杯法的測定。

濾紙片法：溶化好的PDA培養基冷卻到55℃左右，倒平板，平板冷凝后，將活化好的病原菌用無菌水稀釋后涂布到培養基上，在待檢測平板上接上蘸有內生菌過濾液的濾紙片（直徑10mm），然后將平板置于培養箱28℃培養，每個處理3次重復，觀察有無抑菌圈并測量抑菌圈直徑的大小。

牛津杯法：將已滅菌的瓊脂培養基加熱到完全融化，倒在培養皿內，每皿10mL，待其凝固（下層）。此外，將融化的PDA培養基冷卻到50℃左右混入病原菌菌液，將混有菌液的培養基15mL加到已凝固的培養基上待凝固（上層）。以無菌操作在培養基表面直接垂直放上牛津杯（內徑6mm、外徑8mm、高10mm），輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，在杯中加入內生細菌過濾液，加滿后將平板置于培養箱28℃培養，每個處理3次重復，觀察有無抑菌圈并測量抑菌圈直徑的大小。

1.5 內生拮抗細菌的16S rDNA序列分析 將內生拮抗細菌在NA液體培養基中培養24h，用細菌基因組提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取DNA。16S rDNA基因序列擴增采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。

（1）反應體系：25μL反應液中包含10×PCR Buffer 2.5μL，基因組DNA 0.5μL，10mmol dNTP 0.5μL，20umol引物Pf 0.5μL，20umol引物Pr 0.5μL，Taq酶（5U·uL–L）0.5μL，ddH2O2補足25μL。以去離子水為空白對照。

（2）PCR擴增條件：94℃預變性4min;94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸1.5min，35個循環;72℃最后延伸8min。

PCR擴增產物經1%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測定后的DNA序列采用http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/中Blast軟件進行序列同源序列檢索，進行同源性分析，構建系統發育樹，確定菌株的分類地位。

1.6 數據統計與分析 數據統計繪圖用Excel，數據統計分析采用DPS（V7.05）的相應分析功能進行。

2 結果與分析

2.1 內生拮抗細菌的初篩 采用平板對峙法測定內生細菌對食用菌病原菌的拮抗效果，82株內生細菌中有8株內生細菌表現出較好的拮抗效果，菌株分別為JL-B16、JL-A07、JL-B05、JL-B11、CT-B19、CT-B01、CT-B04-1、CT-A16。其中根部內生細菌為2株，占全部內生細菌（82株）的2.44%;鞭部內生細菌為6株，占全部內生細菌（82株）的7.32%。其中內生細菌菌株JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07對6種食用菌病原菌均表現出較好的拮抗效果。

注：“-”表示沒有抑菌效果;“+”表示弱抑菌效果;“++”表示中等抑菌效果;“+++”表示強抑菌效果。

2.2 內生拮抗細菌的復篩 通過濾紙片法、牛津杯法等處理方法對平板初步篩選出的8株內生細菌的拮抗效果進行復篩，8株內生細菌中，內生細菌JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07均表現出了對相應食用菌病原菌具有較好的拮抗作用，效果明顯。

濾紙片法和牛津杯法測定時采用內生細菌發酵過濾液對食用菌病原菌菌絲生長的抑菌影響。從抑菌強度上來看，濾紙片法測定內生細菌JL-B11、CT-B01、CT-B04-1及CT-B19對食用菌病原菌的抑菌效果較弱。牛津杯法測定內生細菌JL-B11、CT-B04-1對食用菌病原菌的抑菌效果較弱。牛津杯法測定CT-B01對蛛網病菌和油疤病菌的抑菌效果明顯;牛津杯法測定CT-B19對油疤病菌和黃色霉菌的抑菌效果明顯（詳見表2）。

通過以上分析可以看出，通過濾紙片法和牛津杯法測定8株內生細菌對食用菌病原菌的拮抗效果，內生細菌JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07拮抗效果明顯，為后續內生拮抗細菌抗病機理研究及防病微生物菌劑的制備奠定了基礎。

2.3 內生拮抗細菌的16S rDNA序列分析 經過克隆測序獲得了4株內生細菌的16S rDNA序列，通過http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/中Blast軟件對4株內生細菌的16S rDNA測序結果進行相似性比對，鑒定細菌的種類。發現4株分離物與已知分類地位菌種的16S rDNA 序列相似性達到了99%～100%，如表3所示。

3 小結與討論

本研究利用平板對峙法、濾紙片法、牛津杯法等方法對82株毛竹內生細菌對主要食用菌病原菌的拮抗效果進行了初篩和復篩。通過平板對峙法對食用菌病原菌的初步篩選，篩選出了JL-B16、JL-A07、JL-B05、JL-B11、CT-B19、CT-B01、CT-B04-1、CT-A16等8株對6種食用菌病原菌具有初步拮抗效果的內生細菌。另外通過濾紙片法、牛津杯法對8株具有初步拮抗效果的內生細菌進行了復篩，篩選出了對主要食用菌病原菌具有較好拮抗效果的4株內生細菌，菌株編號分別是 JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07，通過細菌菌落表征性狀觀察和16S rDNA序列分析，4株內生拮抗細菌菌株分屬于2屬3種，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）和短桿菌屬（Brevibacterium）。

本研究篩選出了對主要食用菌病原菌具有較強拮抗作用的內生細菌，同時表明毛竹具有功能性極其豐富的內生細菌資源，為內生細菌的生物活性物質篩選和開發提供了基礎理論依據，對防病微生物菌劑的制備及應用提供了資源。

基金項目：福建省林業科技項目（2021FKJ07）;閩江學院校級科研項目（MYK19027）;福建省科技計劃項目（2021I0043）。

作者簡介：袁宗勝（1976—），男，高級工程師，從事森林培育及微生物相關領域研究工作。? 收稿日期：2021-06-01

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（責編：王慧晴）