ZBED6基因?qū)Π婉R香豬脾發(fā)育的作用機(jī)制分析

王圣楠，王丹丹，田文杰，2，浦亞斌，潘登科，邢向陽，馬月輝，蔣 琳*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；3.成都中科奧格生物科技有限公司，成都 610000)

豬肉是人類膳食中蛋白質(zhì)的主要來源，在我國國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。隨著人們膳食水平的提高，消費(fèi)者越來越追求食用瘦肉。為提高中國地方豬種的瘦肉含量，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備瘦肉型豬是遺傳育種領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。巴馬香豬是我國主要的地方豬品種，被廣泛用作動(dòng)物模型以研究哺乳動(dòng)物的基因功能。鋅指蛋白6(ZBED6)是一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠通過與IGF2基因相互作用，從而調(diào)節(jié)肌肉的生長發(fā)育。雖然目前已有少量的基因修飾動(dòng)物模型研究ZBED6-IGF2軸對(duì)肌肉發(fā)育的影響，但ZBED6在豬模型中的功能作用尚未被完全探索。本文以ZBED6基因敲除巴馬香豬為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停隗w內(nèi)水平研究ZBED6對(duì)脾組織的作用功能，進(jìn)一步探究轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控生長發(fā)育等相關(guān)的生物學(xué)功能的分子機(jī)制，從而為研究ZBED6基因的更多功能提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)，為我國瘦肉型家豬的育種改良提供思路。ZBED6是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，位于ZC3H11A的第一內(nèi)含子中，是所有胎盤哺乳動(dòng)物所特有的。研究發(fā)現(xiàn)，豬胰島素樣生長因子2(IGF2)內(nèi)含子3的G突變?yōu)锳，使得ZBED6無法與之結(jié)合，從而增加肌肉重量和心的大小，同時(shí)減少脂肪沉積[1-3]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，ZBED6為IGF2的轉(zhuǎn)錄抑制因子，可影響胎盤哺乳動(dòng)物的細(xì)胞增殖、發(fā)育和生長[4]。最近的一項(xiàng)研究表明，ZBED6基因敲除和IGF2敲入導(dǎo)致IGF2的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)小鼠骨骼肌和內(nèi)臟的生長[5]。在中國巴馬香豬中，IGF2敲入使得其產(chǎn)肉量有所提高[6]。目前，ZBED6在中國本土家豬中的研究比較匱乏，其對(duì)巴馬香豬脾發(fā)育的影響和分子機(jī)制尚未明確。本研究以ZBED6基因敲除巴馬香豬為模型載體，對(duì)ZBED6基因敲除巴馬香豬和野生型巴馬香豬的脾組織進(jìn)行表型鑒定以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以揭示ZBED6在脾發(fā)育中的影響和調(diào)控作用，為進(jìn)一步探究ZBED6的分子機(jī)制提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

ZBED6基因敲除巴馬香豬(ZBED6-KO)和同日齡野生型巴馬香豬(WT)來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所大興豬場實(shí)驗(yàn)基地，ZBED6基因的敲除由成都中科奧格生物科技有限公司利用CRISPR/Cas9技術(shù)完成。

1.2 樣品采集及表型鑒定

對(duì)3頭ZBED6基因敲除巴馬香豬(ZBED6-KO)(spleen1、spleen3、spleen6)和3頭同日齡野生型巴馬香豬(WT)(spleen2、spleen4、spleen5)進(jìn)行屠宰，稱取組織重量，同時(shí)采集脾組織樣品，置于RNA-later中，用于RNA的提取。

1.3 RT-qPCR分析IGF2在脾組織中的表達(dá)量

1.3.1 脾組織總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 使用Qiagen公司試劑盒進(jìn)行脾組織RNA的提取，具體操作步驟參照試劑盒使用說明書。每個(gè)樣本取2～3 mg 的組織進(jìn)行裂解勻漿，60 μL的洗脫液洗脫RNA。使用NanoDrop1000檢測RNA濃度及質(zhì)量，OD260 nm/OD280 nm在1.9～2.1之間，RNA濃度>100 ng·μL-1，可用于后續(xù)分析。

1.3.2 定量引物的設(shè)計(jì)合成 NCBI在線網(wǎng)站下載豬IGF2基因的轉(zhuǎn)錄本序列，以β-actin為內(nèi)參基因，利用Primer3.0在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

表1 本試驗(yàn)中使用的RT-qPCR引物序列

1.3.3 RT-qPCR檢測 用TaKaRa公司的SYBR Green Master Mix試劑，以cDNA為模板。在ABI Q7實(shí)時(shí)熒光定量儀(Applied Biosystems, Forest City, CA, SA)上進(jìn)行基因定量分析，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用2-ΔΔct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，若P<0.05，則認(rèn)為差異顯著。

1.4 RNA-Seq

1.4.1 總RNA提取 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄方法同“1.3.1”，使用Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA的總量、濃度和完整度(RIN值)，RNA濃度>100 ng·μL-1，總量≥2.0 μg，且RIN值>7.0，則可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。

1.4.2 RNA-seq文庫構(gòu)建及測序 使用Illumina TruSeq RNA 樣品制備試劑盒，按照說明書要求對(duì)RNA-seq測序所需的cDNA文庫進(jìn)行構(gòu)建。用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS 試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求，用cBot Cluster Generation系統(tǒng)對(duì)含有索引接頭的樣品進(jìn)行聚類，不同文庫按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)量進(jìn)行pooling，用Illumina Hiseq 2500測序平臺(tái)進(jìn)行測序，測序讀長為pair-end(PE)125 bp。

1.5 測序數(shù)據(jù)分析

1.5.1 測序數(shù)據(jù)及原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制 利用NGSQC Toolkit v2.3.3軟件對(duì)下機(jī)后的原始讀數(shù)(reads)進(jìn)行過濾，去除含有索引接頭的reads，去除低質(zhì)量的reads(包括去除N的比例大于10%的reads；去除質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條read的50%以上的reads)，以及過濾后長度小于25 bp的reads。經(jīng)過上述質(zhì)量控制后得到高質(zhì)量的Clean Data。

1.5.2 測序數(shù)據(jù)的比對(duì)與拼接 從Ensemble數(shù)據(jù)庫下載豬11.1版本參考基因組以及基因組注釋文件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Hisat2[7]的默認(rèn)參數(shù)將clean reads與參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，獲取在參考基因組或基因上的位置消息，以及測序樣品特有的序列特征信息。用StringTie[8]軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的組裝，通過Mapped Reads在基因上的位置信息，對(duì)轉(zhuǎn)錄本和基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量，濾掉樣本少于一個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量的數(shù)據(jù)。繼續(xù)使用StringTie軟件將所有樣本的轉(zhuǎn)錄本及參考基因組組裝成新的注釋文件，用于后續(xù)分析。

1.5.3 基因差異表達(dá)分析及層次聚類分析 用R語言的Ballgown包(v2.14.1)對(duì)兩組轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。用FDR法進(jìn)行多重校正，同時(shí)滿足FDR<0.05并且|Fold change|>1.5的基因作為兩組之間的顯著差異表達(dá)基因。

用R語言中pheatmap包的聚類分析函數(shù)對(duì)ZBED6基因敲除豬(ZBED6-KO)及野生(WT)豬脾組織的顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行層次聚類分析[9]。

1.5.4 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析 使用DAVID(v6.8)在線分析軟件對(duì)脾組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析[10]，按照富集倍數(shù)(Fold change)從小到大的原則，使用P值小于0.05作為顯著富集基因的閾值。

1.6 RT-qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

隨機(jī)選取7個(gè)差異表達(dá)基因，采用RT-qPCR方法驗(yàn)證基因表達(dá)水平及測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，驗(yàn)證方法同“1.3”。

2 結(jié) 果

2.1 表型分析結(jié)果

ZBED6-KO豬的脾組織重量顯著高于WT豬(P<0.05，圖1A)，推測ZBED6的敲除對(duì)巴馬香豬脾組織的生長發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。

2.2 IGF2在脾組織中的基因表達(dá)量

IGF2基因在ZBED6-KO豬和WT豬脾組織中的基因相對(duì)表達(dá)量如圖1B所示，結(jié)果顯示，IGF2在ZBED6-KO豬中的表達(dá)量顯著高于WT豬(P<0.05)。

*P<0.05

2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

每個(gè)樣本測序獲得至少4G的數(shù)據(jù)量，Clean data在去除比對(duì)上核糖體數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)后，共得到298 929 423個(gè)clean reads，單個(gè)文庫的總reads在30 134 829～62 565 114個(gè)之間。各樣本clean ratio及Q30 data均在90%以上，測序數(shù)據(jù)符合后續(xù)生物信息分析要求(表2)。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測分析

2.4 參考基因組比對(duì)

通過Hisat比對(duì)，對(duì)所得reads在豬參考基因組及基因上的匹配情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(表3)。測序得到的clean data中，比對(duì)率均在83.94%以上，可以進(jìn)行下一步分析。

表3 轉(zhuǎn)錄組測序基因組比對(duì)分析

2.5 差異表達(dá)基因的篩選

以FDR<0.05，F(xiàn)old Change>2的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，ZBED6-KO豬與WT豬之間共得到161個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的基因90個(gè)，下調(diào)的基因71個(gè)。用R語言的ggplot2軟件包對(duì)差異基因進(jìn)行可視化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 差異表達(dá)基因數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.6 差異表達(dá)基因的聚類分析

ZBED6-KO豬(spleen1、spleen3、spleen6)和WT豬(spleen2、spleen4、spleen5)脾組織之間的差異基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示(圖3)，spleen1和spleen6聚類在一起且基因的上下調(diào)趨勢一致，spleen4先與spleen2聚類在一起，再與spleen5聚類在一起，且spleen4、spleen2和spleen5各個(gè)基因的上下調(diào)趨勢相一致。spleen3與WT豬的3個(gè)樣本聚類在一起，有可能是由于spleen3樣品的個(gè)體差異，總體上，ZBED6-KO豬(spleen1、spleen3、spleen6)的3個(gè)個(gè)體表達(dá)模式相似，ZBED6-WT豬(spleen2、spleen4、spleen5)的3個(gè)個(gè)體表達(dá)模更相似，證明實(shí)驗(yàn)樣品和RNA-seq數(shù)據(jù)可靠。

圖3 161個(gè)差異表達(dá)基因的聚類結(jié)果

2.7 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

利用在線富集分析軟件DAVID對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋，共富集到10條顯著的條目，其中包括5個(gè)生物學(xué)過程條目和5個(gè)分子功能條目(表4)。用R語言的ggplot2軟件包對(duì)GO功能注釋結(jié)果進(jìn)行可視化(圖4)，篩選到一條與肌肉發(fā)育相關(guān)的條目(actin filament severing)。同時(shí)，對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，富集到5條顯著相關(guān)的信號(hào)通路(表5)，同樣用R語言程序包進(jìn)行可視化(圖5)，篩選到一條與肌肉發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路(regulation of actin cytoskeleton)。

圖5 差異基因的KEGG通路富集分析

表4 差異基因的GO分析

圖4 差異基因的GO分析

表5 差異基因的KEGG通路富集分析

2.8 差異表達(dá)基因RT-qPCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取ISG15、CXCL10、PLOD1、BROD2、POLRLD、COG1、FGFR1共7個(gè)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，以β-actin為內(nèi)參基因，7個(gè)差異基因的RT-qPCR結(jié)果(圖6)的表達(dá)模式與測序數(shù)據(jù)的結(jié)果一致，證實(shí)RNA-seq測序的準(zhǔn)確性。

*.P<0.05; **.P<0.01

3 討 論

Jeon等[3,11-12]在豬中發(fā)現(xiàn)，IGF2基因內(nèi)含子3的一個(gè)單堿基突變(G突變?yōu)锳)可增加豬3%～4%的瘦肉量，并且內(nèi)含子3突變的區(qū)域內(nèi)還存在一個(gè)未知抑制因子。后來發(fā)現(xiàn)，這個(gè)未知因子為轉(zhuǎn)錄因子ZBED6[4]。在哺乳動(dòng)物中，ZBED6基因的序列具有高度的保守性和廣泛的組織分布，并可調(diào)節(jié)肌肉的生長發(fā)育。在小鼠、牛、山羊等不同種哺乳動(dòng)物中對(duì)ZBED6的影響與調(diào)控進(jìn)行了一定程度的研究，表明ZBED6能夠調(diào)控肌肉的生長發(fā)育[5,13-14]。近年來的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，將IGF2敲入中國地方巴馬香豬后，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)肉量有所提高[6]。但ZBED6基因?qū)ωi生長發(fā)育的影響尚不清楚，對(duì)脾生長發(fā)育的作用機(jī)制也不明晰。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，ZBED6-KO豬脾組織的IGF2表達(dá)量顯著高于野生型，這與之前在小鼠和肉牛中的結(jié)果相符[4,15-21]。ZBED6-KO豬的脾組織重量較WT豬增加，且差異顯著。這些結(jié)果暗示，ZBED6基因的敲除能夠促進(jìn)脾組織的生長發(fā)育。ZBED6-KO豬和WT豬脾組織的轉(zhuǎn)錄組中共得到161個(gè)差異基因，這些差異基因主要參與肌動(dòng)蛋白絲切斷、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、T細(xì)胞的趨化作用等于肌肉發(fā)育相關(guān)及免疫反應(yīng)的生物學(xué)過程和通路。

在篩選到的與肌肉發(fā)育相關(guān)的通路中，涉及DSTN、FGFR1、LIMK1、MAPK3、CFL1、NCKAP1L、ITGB3、MSN、PPP1CC基因，推測ZBED6可能通過影響這些基因的表達(dá)及其所在通路進(jìn)而調(diào)控脾組織的生長發(fā)育。

在涉及的9個(gè)基因中，F(xiàn)GFR1(成纖維細(xì)胞因子Ⅰ型受體)為成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)之一，其作為受體酪氨酸激酶超家族的成員，能與成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)結(jié)合，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和存活，對(duì)胚胎發(fā)育、器官形成、血管生成、組織修復(fù)及代謝調(diào)控等生理功能發(fā)揮重要作用[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR1功能喪失性突變可引起人類Kallmann綜合征，導(dǎo)致生長緩慢，個(gè)子矮小[24]。最近一項(xiàng)研究表明，F(xiàn)GFR1是肢芽發(fā)生、發(fā)育和趾骨圖式發(fā)育所必需的。在胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)GFR1基因在肢芽的間質(zhì)和中胚層側(cè)板、體節(jié)和其它退化器官中表達(dá)，表明在骨骼發(fā)育中可能有一定的作用[25-27]。本研究中，ZBED6-KO豬FGFR1基因的表達(dá)量是野生型的1.98倍，推測ZBED6基因的敲除通過上調(diào)FGFR1基因的表達(dá)，促進(jìn)巴馬香豬脾組織的生長發(fā)育。

肌動(dòng)蛋白絲(也稱微絲)為肌動(dòng)蛋白的組成元件之一，是真核生物細(xì)胞骨架的必需成分。它不僅參與了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸和肌肉的收縮，還與細(xì)胞的移動(dòng)以及細(xì)胞分裂等活動(dòng)有關(guān)，其形成的大規(guī)模網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)、形狀提供機(jī)械支持以及傳導(dǎo)信號(hào)等諸多功能[28]，對(duì)細(xì)胞的增殖也有重要影響[29]。哺乳動(dòng)物的減數(shù)分裂高度依賴于完整的微絲網(wǎng)絡(luò)[28]。DSTN又稱絲切蛋白(ADF)，屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白ADF家族，廣泛存在于真核生物中，對(duì)細(xì)胞生長發(fā)育至關(guān)重要，是組織肌絲中必需成分[30]。在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)分裂和其他細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過程中起著加速微絲翻轉(zhuǎn)的作用[28,31-33]，能提高肌動(dòng)蛋白的周轉(zhuǎn)速度。ADF蛋白能夠與肌動(dòng)蛋白絲(F-肌動(dòng)蛋白)以1∶1的比例結(jié)合，誘導(dǎo)微絲解聚[34-38]，切斷肌動(dòng)蛋白絲(F-肌動(dòng)蛋白)并與肌動(dòng)蛋白單體(G-肌動(dòng)蛋白)結(jié)合[29,38-40]。DSTN在ZBED6-KO豬脾組織中的表達(dá)量較WT顯著升高，推測在巴馬香豬脾組織中ZBED6基因通過調(diào)控DSTN基因的表達(dá)，促進(jìn)脾組織中細(xì)胞的增殖分裂活動(dòng)及生長發(fā)育。

ZBED6基因敲除后，除了影響脾和肌肉發(fā)育，同樣影響了巴馬香豬脾組織免疫相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程，這與脾組織作為淋巴器官之一也有一定的關(guān)系。在與免疫反應(yīng)相關(guān)的通路中，富集到的主要基因?yàn)镃XCL10、CXCL11、PLD2、LIMK1、MAPK3、CFL1。

LIMK1為一種位于Rho家族下游的絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，是絲切蛋白的上游調(diào)控因子，通過影響絲切蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的活性，從而防止肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的降解，還可抑制腫瘤的遷移[41]。LIMK1在多種腫瘤中，如惡性黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌等過表達(dá)[42]。在上游信號(hào)分子介導(dǎo)的信號(hào)通路中，LIMK1處于中心地位，可能為腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲的重要靶點(diǎn)[43-44]。而沉默LIMK1基因可減少胰腺癌細(xì)胞及腫瘤誘導(dǎo)的血管形成[45]。LIMK1基因在ZBED6-KO豬脾組織中的表達(dá)量較野生型有顯著降低，因此推測，ZBED6基因的敲除有可能降低巴馬香豬脾組織中腫瘤發(fā)生的可能性，進(jìn)而提高其抗病能力。

CXCL10基因(CXC趨化因子配體10)又稱干擾素誘導(dǎo)蛋白(IP-10)，是CXC趨化因子超家族中的一員，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、血管生成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及細(xì)胞增殖等作用。多項(xiàng)研究表明，CXCL10與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療療效以及預(yù)后相關(guān)[46-47]。CXCL10與CXCR3受體結(jié)合，抑制黑色素瘤血管生成作用，降低腫瘤內(nèi)血管密度，增加癌細(xì)胞凋亡，使癌組織壞死[48]。Giuliani等[46]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細(xì)胞可通過自分泌方式分泌CXCL10，隨后與骨髓瘤細(xì)胞上的CXCR3B受體結(jié)合，縮短腫瘤細(xì)胞的生存時(shí)間發(fā)揮抗增殖效應(yīng)。本研究中CXCL10在ZBED6-KO豬脾組織中表達(dá)量是WT豬的1.87倍，CXCL10表達(dá)量顯著升高增強(qiáng)了家豬抵御腫瘤的抗病能力。

4 結(jié) 論

與野生型巴馬香豬相比，敲除ZBED6基因之后，顯著提高了豬的脾組織重量。IGF2作為ZBED6轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控基因，與組織的生長發(fā)育密切相關(guān)。在ZBED6-KO豬中，脾組織的IGF2基因表達(dá)量顯著升高。ZBED6-KO豬與WT豬相比較共篩選到161個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因90個(gè)，下調(diào)基因71個(gè)；差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析篩選到2條與肌肉生長發(fā)育顯著相關(guān)的通路，即肌動(dòng)蛋白絲切斷和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。由此推測，ZBED6基因的敲除可能通過上述生物學(xué)過程和通路影響了脾組織的生長發(fā)育。