CK 免疫組化聯(lián)合EBER 原位雜交在鼻咽癌診斷中的作用分析

古彩紅，謝曉丹，陳思琦

廣東省惠州市第三人民醫(yī)院病理科，廣東惠州 516002

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽腔頂部或側(cè)壁的惡性腫瘤，我國(guó)兩廣地區(qū)發(fā)病率較高[1]。放化療是常用的治療手段，但由于大多數(shù)患者出現(xiàn)明顯病情時(shí)已處于中晚期階段，且鼻咽癌易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，使得預(yù)后不佳[2-4]。因此，對(duì)鼻咽癌的早期診斷具有重要意義。雖然影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，使各種影像學(xué)診斷方法不斷進(jìn)步，但病理活檢依然是診斷疾病最可靠的方法。 EB病毒（EBV）與鼻咽癌的發(fā)病具有密切關(guān)系，通過(guò)原位雜交的方法EBV 編碼的小分子RNA-EBER 能夠定量檢測(cè)組織中EBV 的含量[5]。 細(xì)胞角蛋白CK 是上皮細(xì)胞的標(biāo)記物，能夠勾勒出細(xì)胞的形態(tài)。 該研究選取2016 年1 月—2019 年12 月在惠州市第三人民醫(yī)院確診為鼻咽癌的112 例患者作為研究組，探究CK 免疫組化聯(lián)合EBER 原位雜交在鼻咽癌診斷中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在惠州市第三人民醫(yī)院確診為鼻咽癌的112 例患者作為研究組，收集以上患者鼻咽癌活檢標(biāo)本。 112 例患者中男 83 例，女 29 例；年齡 19～80 歲，平均年齡（51.16±12.25）歲；疾病種類均為未分化型非角化癌，且均未經(jīng)過(guò)放化療或其他方法治療。 并選取同期于該院進(jìn)行鼻咽活檢診斷為鼻咽黏膜慢性炎癥患者30 例作為對(duì)照組，對(duì)照組中男21 例，女9 例；年齡 21～76 歲，平均年齡（53.14±17.52）歲。 兩組患者的性別、年齡等一般資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，且所選病例均通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

CK 免疫組化：①組織處理：患者組織塊獲得后置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，采用脫水透明浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋。 ②組織切片：將組織切成4 μm 的薄片，免疫組織化學(xué)方法采用EnVision 二步法，滴加過(guò)氧化物酶阻斷劑（3%過(guò)氧化氫）和動(dòng)物非免疫血清（羊），小鼠單克隆抗體 CK、二抗（羊抗鼠/兔 IgG 聚合物）等試劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

EBER 原位雜交：①組織處理：患者組織塊獲得后置于10%中性甲醛溶液中固定24 h， 采用脫水透明浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋。 ②組織切片：將組織切成4 μm 的薄片，黏附在防脫玻片上，60℃烤片 1～2 h，切片脫蠟后經(jīng)胃蛋白酶消化，脫水。③雜交：組織上滴加EBER 探針 10 μl， 加硅化蓋玻片， 橡膠水泥封邊。37℃雜交孵育過(guò)夜（濕盒內(nèi)）；④二抗敷育：去除雜交蓋玻片后 PBS 緩沖液沖洗 6 min，滴加二抗 50 μl，37℃濕盒內(nèi)孵育 30 min。 ⑤DAB 顯色：PBS 緩沖液沖洗后DAB 顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。 其中 EBER 原位雜交試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組患者鼻咽組織中CK 免疫組化及E BER 原位雜交陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)的比例；②觀察鼻咽癌患者CK 免疫組化及EBER 原位雜交陽(yáng)性細(xì)胞的狀態(tài)；③計(jì)算CK 免疫組化及EBER 原位雜交診斷鼻咽癌的臨床效能。

1.4 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

CK 免疫組化：細(xì)胞膜或胞質(zhì)呈現(xiàn)黃色或棕黃色，未出現(xiàn)棕黃色或黃色細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞即定為陰性細(xì)胞。

EBER 原位雜交：細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黑色顆粒即為陽(yáng)性細(xì)胞，未出現(xiàn)棕黑色顆粒的細(xì)胞為陰性細(xì)胞。

所有片子均經(jīng)過(guò)兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理診斷醫(yī)師進(jìn)行診斷。在每張切片上隨機(jī)選取10 個(gè)中倍視野，采用image pro plus 軟件記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽活檢組織中CK 及EBER 的表達(dá)情況

112 例非角化型未分化癌患者的組織切片中，99例EBER 原位雜交結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性， 診斷陽(yáng)性率為88.39%，30 例鼻咽黏膜慢性炎癥患者的EBER 原位雜交結(jié)果無(wú)陽(yáng)性；CK 免疫組化結(jié)果顯示，96 例患者呈現(xiàn)陽(yáng)性，診斷陽(yáng)性率為85.71%，30 例鼻咽黏膜慢性炎癥患者的CK 免疫組化結(jié)果無(wú)陽(yáng)性。 見(jiàn)表1。

表1 鼻咽活檢組織中CK 及EBER 的表達(dá)情況[n(%)]

2.2 CK 及EBER 診斷鼻咽癌的臨床效能

CK 與EBER 聯(lián)合檢測(cè)診斷鼻咽癌的靈敏度、特異性、 準(zhǔn)確性、 陽(yáng)性預(yù)測(cè)率及陰性預(yù)測(cè)率分別為97.32%、100.00%、97.89%、100.00%及 90.91%， 高于兩種指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)的靈敏度、 準(zhǔn)確率及陰性預(yù)測(cè)率，具有較高的臨床效能。 見(jiàn)表2。

表2 CK 及EBER 診斷鼻咽癌的臨床效能（%）

3 討論

鼻咽癌是我國(guó)常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤， 在國(guó)外，鼻咽癌的發(fā)病率低于1/10 萬(wàn)， 我國(guó)鼻咽癌發(fā)病率顯著高于此值，且在我國(guó)華南地區(qū)，鼻咽癌的發(fā)病率高達(dá)30/10 萬(wàn)[6]。 因此，對(duì)于鼻咽癌的早期診斷及治療在我國(guó)存在重要意義。 EB 病毒是一種雙鏈DNA 病毒，對(duì)人類的侵染能力較強(qiáng)，許多研究顯示，EB 病毒的侵染與多種腫瘤的發(fā)病存在聯(lián)系， 其中最為明顯的為EB 病毒與鼻咽癌及地方性Burkitt 淋巴瘤的關(guān)系[7]。目前臨床上對(duì)于鼻咽癌的診斷常采用檢測(cè)患者血清EB 病毒抗體的含量進(jìn)行，但在可疑患者的診斷上，血清EB 病毒抗體的檢測(cè)未顯示出特異性。

EBER 是 EB 病毒編碼的一種小 RNA， 在 EB 病毒感染的細(xì)胞中大量拷貝， 單細(xì)胞拷貝數(shù)達(dá)到106～107。 檢測(cè)組織中EBER 的含量能夠顯示組織及細(xì)胞中EB 病毒的侵染程度[8]。EBER 原位雜交被認(rèn)為是檢測(cè)組織中EB 病毒的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。 該研究使用EBER 的翻譯核苷酸作為探針，能夠與組織中的EBER 進(jìn)行互補(bǔ)雜交，顯著提高檢測(cè)靈敏度。

細(xì)胞角蛋白CK 在上皮細(xì)胞中的表達(dá)較為豐富，且能夠作為組織及細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志，在各種腫瘤細(xì)胞的來(lái)源、預(yù)后判定中起重要作用。 與EBER 操作過(guò)程不同，CK 的免疫組化操作不需要特定的抗污染等操作的防范作用，因此結(jié)果可靠。 由以上結(jié)果可知，兩組鼻咽活檢組織中EBER 及CK 診斷陽(yáng)性率分別為88.39%、85.71%， 兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=87.571、79.379，P＜0.05），與彭忠異等[10]學(xué)者在相關(guān)研究中得出，在鼻咽癌活檢組織中EBER 及CK 診斷陽(yáng)性率分別為91.7%、79.2%， 與該文所得結(jié)果相近。CK 與EBER 聯(lián)合檢測(cè)診斷鼻咽癌的靈敏度、特異性、 準(zhǔn)確性、 陽(yáng)性預(yù)測(cè)率及陰性預(yù)測(cè)率分別為97.32%、100.00%、97.89%、100.00%及 90.91%。 能夠顯著提升兩種指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)時(shí)的靈敏度及陰性預(yù)測(cè)率，具有一定的意義。

綜上所述，雖然該研究結(jié)果顯示CK 與EBER 聯(lián)合檢測(cè)鼻咽癌具有一定的臨床價(jià)值，但在接下來(lái)的研究中，仍需要探索更多檢測(cè)方法，以提高早期尤其是低分化鼻咽癌的診斷方法，如與微電流檢測(cè)等技術(shù)聯(lián)用，以提高鼻咽癌的臨床診斷率，促進(jìn)早期鼻咽癌的發(fā)現(xiàn)及治療。