耐喹諾酮類腸球菌耐藥機制研究

郭麗娜

內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科,內(nèi)蒙古包頭 014030

目前， 抗菌藥物在臨床中的使用面積越來越廣泛， 但是抗菌類藥物的長期使用會誘發(fā)耐藥性的問題，對于整體的治療效果造成極大影響，這也是醫(yī)學界不得不重視的一項嚴峻問題。 在臨床中，細菌耐藥性產(chǎn)生的過程十分復雜,腸球菌也不例外。 在臨床中如果對其機制展開深入研究，將幫助臨床工作者通過多渠道逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性問題,從而使抗菌藥物更好地服務于臨床，并以此為依據(jù)開發(fā)出各類新藥。 從當前的研究來看，喹諾酮耐藥機制主要包括特異性和非特異性，不過目前腸球菌對喹諾酮耐藥性的問題形勢嚴峻；為了更好地合理應用抗生素，醫(yī)務人員必須堅持對抗生素耐藥性的監(jiān)測， 同時掌握細菌耐藥性的變遷，以此來探索耐藥機制，這也是抗菌類藥物合理應用的根本途徑。

1 研究喹諾酮類抗生素耐藥問題的背景

在臨床中可引起感染的病原菌較多，其中大腸埃希菌是極其常見的一種細菌。 據(jù)有關(guān)研究統(tǒng)計，目前全球大約每年有超過6 億的人口因大腸埃希菌而發(fā)生感染，甚至導致＞80 萬的患兒死亡，所以這種病菌對于人類健康的威脅極大，而且感染面積較廣，因此必須選擇一種可以廣泛應用，且殺菌效果極佳的抗生素藥物進行治療。 不過單純從耐藥性角度分析來看，實際上大腸埃希菌在抗生素未發(fā)現(xiàn)前便已經(jīng)有耐藥性，這一研究結(jié)果早在1940 年便已經(jīng)得出，這也說明耐藥性的產(chǎn)生原因不僅僅和抗生素藥物的廣泛使用有關(guān)，與此同時也可能在對抗惡劣環(huán)境中產(chǎn)生[1]。 不過在未使用抗生素的前提下就產(chǎn)生耐藥性，僅僅會出現(xiàn)在個別細菌中存在，整體而言比較少見。一般來說，耐藥性大多由抗生素引起。 20 世紀60 年代時，臨床中又發(fā)現(xiàn)了多重耐藥性大腸埃希菌，這一現(xiàn)象也明確指出，每推出一種新藥便會出現(xiàn)相應的耐藥菌株，尤其在大腸埃希菌中，這種更新?lián)Q代的特征極其鮮明。 等到80 年代，諾氟沙星廣泛應用后，臨床中出現(xiàn)了一批大量含類氟的氟喹諾酮類衍生物，因為該藥物抗菌能力較強，因此在應用方面得到很大推廣，這也是近年來對抗大腸埃希菌療效最突出的一種藥物。但是隨著此類藥物的廣泛應用， 尤其很多不合理抗生素濫用，致使臨床中出現(xiàn)很多多重耐藥性大腸埃希菌，因此喹諾酮類藥物的耐藥性問題也在逐漸加劇。

2 喹諾酮類抗生素耐藥現(xiàn)狀

奎諾酮類藥物從發(fā)布以來得到廣大臨床醫(yī)師認可，其療效同樣極其顯著，而近年來因為該藥物應用面積逐漸擴大，因此耐藥性的問題日益嚴峻。 以腸球菌為例， 當前世界范圍內(nèi)已出現(xiàn)不同程度的耐藥菌株，其中臺灣大腸埃希菌對喹諾酮藥物的耐藥率高達20%左右，美國高達10%，在中國則高居全球首位。通過以往的相關(guān)報道來看， 我國從1994 年開始統(tǒng)計大腸埃希菌對喹諾酮類藥物的耐藥率，當時大約維持在50%左右，但是翻看近幾年的報道，我國部分地區(qū)甚至超過70%[2]。 同樣需要注意的一項問題是，在臨床中很多新上市的喹諾酮類藥物在應用初期時雖然耐藥率較低，但是在應用數(shù)年后，同樣也會出現(xiàn)耐藥菌株，而且整體的耐藥率增長極快。 面對這一嚴峻的耐藥現(xiàn)狀，當然與抗生素的廣泛應用密不可分，同時該藥物在治療呼吸系統(tǒng)感染疾病時效果極其顯著，因此喹諾酮類藥物的銷售趨勢常年呈增長狀態(tài)， 到2010年時，喹諾酮類抗生素在全國的銷量已明顯超過頭孢類抗生素，在抗菌藥物市場中占據(jù)著重要份額，也正是在這種濫用的背景下， 使得耐藥性問題層出不窮。而且大量的新藥不斷研發(fā)使得新的耐藥問題也在不間斷地產(chǎn)生。 另外還需要注意的一點是，喹諾酮類藥物在我國除了用于醫(yī)療外，還被應用到消毒、畜牧等行業(yè)，因此波及的面積極為廣泛。

3 喹諾酮對細菌的作用機制

早在20 世紀70 年代時， 國外學者便發(fā)現(xiàn)DNA消旋酶，在通過一系列大量的科學考察后，以大腸埃希氏菌為例， 該病菌的DNA 消旋酶可以被萘啶酸抑制。 然后將萘啶酸耐藥菌進行分離，單獨取出該病菌的DNA 消旋酶后發(fā)現(xiàn)對于萘啶酸具有一定的耐藥性。 因此在后續(xù)的醫(yī)學研究中指出，諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的作用靶位便為DNA 消旋酶。 直到20 世紀90 年代，克隆出拓撲異構(gòu)酶IV 基因，同樣在類似的臨床研究中表明， 拓撲異構(gòu)酶IV 基因可以被喹諾酮類抗生素抑制，說明喹諾酮類抗生素對大腸埃希氏菌感染有治療作用， 同時也可以得出拓撲異構(gòu)酶IV 是喹諾酮類藥物的靶位[3]。

4 藥物靶位-拓撲異構(gòu)酶II 的改變

4.1 DNA 促旋酶和拓撲異構(gòu)酶IV 變異

撲異構(gòu)酶 IV 的 ParC 和 ParE 分別與 DNA 促旋酶的GyrA 和GyrB 亞基同源。 而在糞腸球菌中，任何一項基因發(fā)生突變都會影響喹諾酮與靶位的結(jié)合，這也是耐藥性問題無法得到妥善解決的重要因素[4]。 例如大腸埃希氏菌在靠近GyrA 基因的5’端時會出現(xiàn)高度保守區(qū)域， 該區(qū)域也與喹諾酮類藥物耐藥性有緊密關(guān)系，在醫(yī)學中被稱之為喹諾酮類藥物耐藥性決定區(qū)。

4.2 喹諾酮抗菌藥程度和靶酶變異的關(guān)系

在腸球菌中， 其耐藥性水平和DNA 促旋酶以及拓撲異構(gòu)酶有直接關(guān)聯(lián)，并且取代數(shù)目增加，那藥性隨之也會發(fā)生增高。在程健恒等[5]人的研究中指出，42株糞腸球菌僅攜帶有ParC 單位點氨基酸改變的臨床株。 進一步研究時發(fā)現(xiàn)， 環(huán)丙沙星的MIC 值大約在1.52～3.30μg/mL，與此同時攜帶有 GyrA 和 ParC 的雙位點突變臨床株， 對應的 MIC 值為 30～90μg/mL，從這一研究中可以看出， 后者的數(shù)值是前者的幾十倍。另外在章卓亮等[6]人的研究中也發(fā)現(xiàn)，在對18 株屎腸球菌進行研究，其中17 例出現(xiàn)突變位點。環(huán)比沙星的MIC 值大約為 8 μg/mL， 其余菌株均攜帶 GyrA 和ParC 雙位點突變，相應的 mic 值為 32～249 μg/mL，也是前者的數(shù)十倍之高。

4.3 喹諾酮耐藥程度和靶酶關(guān)系

喹諾酮與靶酶間的關(guān)系具有選擇性，用藥后會選擇具體與哪一種酶為主要靶酶，實際上需要參考的因素眾多，例如結(jié)構(gòu)、藥敏反應等，與此同時，對于耐藥性也會產(chǎn)生直觀影響[7]。而在大量的研究中也發(fā)現(xiàn)，對于較高水平的耐藥性，往往需要兩種靶酶同時發(fā)生突變才可能生成，因此概率相對較小[8]。從這一研究中可以發(fā)現(xiàn)，一般在藥物中、低濃度便發(fā)生突變的酶，是首要靶位；反之則為次要靶位。 而革蘭氏陰性菌主要靶酶為DNA 消旋酶；陽性菌中則為拓撲異構(gòu)酶IV。 龍永艷等[9]人對糞腸球菌的研究中發(fā)現(xiàn)非基因突變的臨床株對于喹諾酮類抗菌藥的耐藥水平有很大影響，觀察中還發(fā)現(xiàn)MIC 值介于無突變株和同時存在GyrA和ParC 基因突變株之間， 這說明在糞腸球菌對喹諾酮類藥物耐藥性中，拓撲異構(gòu)酶IV 是首要靶位。

4.4 喹諾酮結(jié)構(gòu)和靶酶的關(guān)系

在腸球菌選擇具體何種酶作為首要靶酶時，實際上與抗菌藥結(jié)構(gòu)方面的關(guān)系十分密切，因此不同藥物結(jié)構(gòu)作用的靶酶，也會存在一定差異[10]。 如左氧氟沙星主要靶酶為DNA 促旋酶；同樣有研究指出，環(huán)丙沙星在用于治療屎腸球菌時， 誘發(fā)ParC 基因突變的概率更高，說明主要靶酶拓撲異構(gòu)酶IV。

5 藥物的排外特性

細菌細胞膜上有外排泵， 當人提服用藥物后，會有選擇地將藥物排出細胞外，因此細菌不至于被高濃度藥物殺死，確保細菌存活，這也是形成耐藥性的一大重要原因[11]。 而在相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)，細胞的排外系統(tǒng)具有不同類型，例如根據(jù)能量形式和結(jié)構(gòu)可以進行區(qū)分；另外也可以通過電化學質(zhì)子梯度來外排藥物運轉(zhuǎn)系統(tǒng)。

在分析腸球菌時可發(fā)現(xiàn)， 該病菌具有外排系統(tǒng)，無論何種菌株，其主動排外現(xiàn)象均存在，這與藥物的低敏感度有很大關(guān)聯(lián)，其中也有研究證明，腸球菌敏感株對諾氟沙星等藥物具有主動外排能力[12]。

6 腸球菌的多重耐藥外排泵EmeA

細菌易化族類物質(zhì)會介導病菌對喹諾酮類抗菌藥產(chǎn)生耐藥性，通常EmeA 蛋白會引起耐藥的不僅僅單純指喹諾酮類藥物，還包含多種結(jié)構(gòu)上與之相似的無關(guān)藥物[13]。 在臨床中，通過將基因缺失菌株和基因互補株對諾氟沙星的MIC 值進行比較， 發(fā)現(xiàn)對諾氟沙的敏感性相較于野生株高兩倍。 丁月平等[14]人也研究了EmeA 的外排泵外排活性，通過將糞腸球菌的一條片段克隆到大腸艾希氏菌，經(jīng)過測量顯示，這一片段還有兩個開放讀碼框， 其中之一便是emeA 基因，再將其克隆到大腸艾希氏菌上，發(fā)現(xiàn)耐藥性提高了四倍以上[15]。

7 腸球菌耐藥性預防

腸球菌和革蘭陽性菌不同，它對多種抗菌藥物具有固有或獲得耐藥機制，所以實際的耐藥情況十分復雜，例如對于青霉素等藥物的耐藥機制是由低親和力青霉素結(jié)合蛋白過量產(chǎn)生而使得細胞膜滲透力下降所致；反觀對于喹諾酮類抗菌藥，則由螺旋酶和拓撲異構(gòu)酶IV 位點的改變，致使諾耐藥性產(chǎn)生[16]。 而有研究也表明，屎腸球菌和糞腸球菌對青霉素、環(huán)丙沙星的耐藥敏感率均高于70%，不過腸球菌對于氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)出天然低水平耐藥，所以在臨床中也有學者提議，需要檢測腸球菌對于高濃度青大霉素以及鏈霉素等藥物的敏感性，以此來推測耐藥性；當然為了降低耐藥性，臨床中也主張聯(lián)合用藥[17]。 但是近年來，隨著耐藥腸球菌的感染者逐漸增多，且缺乏較為可靠的治療藥物，在未進一步做出深入研究前，臨床醫(yī)師仍然要嚴格控制抗生素使用，避免其引起醫(yī)院感染爆發(fā)。

綜上所述，目前在臨床中，腸球菌對于喹諾酮抗菌藥的耐藥性日漸提升，所以深入研究耐藥機制十分重要。 而據(jù)當前的研究發(fā)現(xiàn)，耐藥機制要么局限于靶酶突變，要么局限于藥物的主動排外。 在今后的研究中，應當將耐藥性、靶酶突變以及藥物主動排外相聯(lián)合，根據(jù)結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系，研究藥物與酶之間的相互作用。 在研究的同時也需要對喹諾酮類藥物進行深度開發(fā)，使之療效更加確切，同時成為同時作用于DNA 促旋酶和拓撲異構(gòu)酶IV 的新型喹諾酮類抗菌藥。