耐喹諾酮類腸球菌耐藥機制研究

郭麗娜

內蒙古包頭醫學院第二附屬醫院檢驗科,內蒙古包頭 014030

目前， 抗菌藥物在臨床中的使用面積越來越廣泛， 但是抗菌類藥物的長期使用會誘發耐藥性的問題，對于整體的治療效果造成極大影響，這也是醫學界不得不重視的一項嚴峻問題。 在臨床中，細菌耐藥性產生的過程十分復雜,腸球菌也不例外。 在臨床中如果對其機制展開深入研究，將幫助臨床工作者通過多渠道逆轉細菌耐藥性問題,從而使抗菌藥物更好地服務于臨床，并以此為依據開發出各類新藥。 從當前的研究來看，喹諾酮耐藥機制主要包括特異性和非特異性，不過目前腸球菌對喹諾酮耐藥性的問題形勢嚴峻；為了更好地合理應用抗生素，醫務人員必須堅持對抗生素耐藥性的監測， 同時掌握細菌耐藥性的變遷，以此來探索耐藥機制，這也是抗菌類藥物合理應用的根本途徑。

1 研究喹諾酮類抗生素耐藥問題的背景

在臨床中可引起感染的病原菌較多，其中大腸埃希菌是極其常見的一種細菌。 據有關研究統計，目前全球大約每年有超過6 億的人口因大腸埃希菌而發生感染，甚至導致＞80 萬的患兒死亡，所以這種病菌對于人類健康的威脅極大，而且感染面積較廣，因此必須選擇一種可以廣泛應用，且殺菌效果極佳的抗生素藥物進行治療。 不過單純從耐藥性角度分析來看，實際上大腸埃希菌在抗生素未發現前便已經有耐藥性，這一研究結果早在1940 年便已經得出，這也說明耐藥性的產生原因不僅僅和抗生素藥物的廣泛使用有關，與此同時也可能在對抗惡劣環境中產生[1]。 不過在未使用抗生素的前提下就產生耐藥性，僅僅會出現在個別細菌中存在，整體而言比較少見。一般來說，耐藥性大多由抗生素引起。 20 世紀60 年代時，臨床中又發現了多重耐藥性大腸埃希菌，這一現象也明確指出，每推出一種新藥便會出現相應的耐藥菌株，尤其在大腸埃希菌中，這種更新換代的特征極其鮮明。 等到80 年代，諾氟沙星廣泛應用后，臨床中出現了一批大量含類氟的氟喹諾酮類衍生物，因為該藥物抗菌能力較強，因此在應用方面得到很大推廣，這也是近年來對抗大腸埃希菌療效最突出的一種藥物。但是隨著此類藥物的廣泛應用， 尤其很多不合理抗生素濫用，致使臨床中出現很多多重耐藥性大腸埃希菌，因此喹諾酮類藥物的耐藥性問題也在逐漸加劇。

2 喹諾酮類抗生素耐藥現狀

奎諾酮類藥物從發布以來得到廣大臨床醫師認可，其療效同樣極其顯著，而近年來因為該藥物應用面積逐漸擴大，因此耐藥性的問題日益嚴峻。 以腸球菌為例， 當前世界范圍內已出現不同程度的耐藥菌株，其中臺灣大腸埃希菌對喹諾酮藥物的耐藥率高達20%左右，美國高達10%，在中國則高居全球首位。通過以往的相關報道來看， 我國從1994 年開始統計大腸埃希菌對喹諾酮類藥物的耐藥率，當時大約維持在50%左右，但是翻看近幾年的報道，我國部分地區甚至超過70%[2]。 同樣需要注意的一項問題是，在臨床中很多新上市的喹諾酮類藥物在應用初期時雖然耐藥率較低，但是在應用數年后，同樣也會出現耐藥菌株，而且整體的耐藥率增長極快。 面對這一嚴峻的耐藥現狀，當然與抗生素的廣泛應用密不可分，同時該藥物在治療呼吸系統感染疾病時效果極其顯著，因此喹諾酮類藥物的銷售趨勢常年呈增長狀態， 到2010年時，喹諾酮類抗生素在全國的銷量已明顯超過頭孢類抗生素，在抗菌藥物市場中占據著重要份額，也正是在這種濫用的背景下， 使得耐藥性問題層出不窮。而且大量的新藥不斷研發使得新的耐藥問題也在不間斷地產生。 另外還需要注意的一點是，喹諾酮類藥物在我國除了用于醫療外，還被應用到消毒、畜牧等行業，因此波及的面積極為廣泛。

3 喹諾酮對細菌的作用機制

早在20 世紀70 年代時， 國外學者便發現DNA消旋酶，在通過一系列大量的科學考察后，以大腸埃希氏菌為例， 該病菌的DNA 消旋酶可以被萘啶酸抑制。 然后將萘啶酸耐藥菌進行分離，單獨取出該病菌的DNA 消旋酶后發現對于萘啶酸具有一定的耐藥性。 因此在后續的醫學研究中指出，諾酮類藥物產生耐藥性的作用靶位便為DNA 消旋酶。 直到20 世紀90 年代，克隆出拓撲異構酶IV 基因，同樣在類似的臨床研究中表明， 拓撲異構酶IV 基因可以被喹諾酮類抗生素抑制，說明喹諾酮類抗生素對大腸埃希氏菌感染有治療作用， 同時也可以得出拓撲異構酶IV 是喹諾酮類藥物的靶位[3]。

4 藥物靶位-拓撲異構酶II 的改變

4.1 DNA 促旋酶和拓撲異構酶IV 變異

撲異構酶 IV 的 ParC 和 ParE 分別與 DNA 促旋酶的GyrA 和GyrB 亞基同源。 而在糞腸球菌中，任何一項基因發生突變都會影響喹諾酮與靶位的結合，這也是耐藥性問題無法得到妥善解決的重要因素[4]。 例如大腸埃希氏菌在靠近GyrA 基因的5’端時會出現高度保守區域， 該區域也與喹諾酮類藥物耐藥性有緊密關系，在醫學中被稱之為喹諾酮類藥物耐藥性決定區。

4.2 喹諾酮抗菌藥程度和靶酶變異的關系

在腸球菌中， 其耐藥性水平和DNA 促旋酶以及拓撲異構酶有直接關聯，并且取代數目增加，那藥性隨之也會發生增高。在程健恒等[5]人的研究中指出，42株糞腸球菌僅攜帶有ParC 單位點氨基酸改變的臨床株。 進一步研究時發現， 環丙沙星的MIC 值大約在1.52～3.30μg/mL，與此同時攜帶有 GyrA 和 ParC 的雙位點突變臨床株， 對應的 MIC 值為 30～90μg/mL，從這一研究中可以看出， 后者的數值是前者的幾十倍。另外在章卓亮等[6]人的研究中也發現，在對18 株屎腸球菌進行研究，其中17 例出現突變位點。環比沙星的MIC 值大約為 8 μg/mL， 其余菌株均攜帶 GyrA 和ParC 雙位點突變，相應的 mic 值為 32～249 μg/mL，也是前者的數十倍之高。

4.3 喹諾酮耐藥程度和靶酶關系

喹諾酮與靶酶間的關系具有選擇性，用藥后會選擇具體與哪一種酶為主要靶酶，實際上需要參考的因素眾多，例如結構、藥敏反應等，與此同時，對于耐藥性也會產生直觀影響[7]。而在大量的研究中也發現，對于較高水平的耐藥性，往往需要兩種靶酶同時發生突變才可能生成，因此概率相對較小[8]。從這一研究中可以發現，一般在藥物中、低濃度便發生突變的酶，是首要靶位；反之則為次要靶位。 而革蘭氏陰性菌主要靶酶為DNA 消旋酶；陽性菌中則為拓撲異構酶IV。 龍永艷等[9]人對糞腸球菌的研究中發現非基因突變的臨床株對于喹諾酮類抗菌藥的耐藥水平有很大影響，觀察中還發現MIC 值介于無突變株和同時存在GyrA和ParC 基因突變株之間， 這說明在糞腸球菌對喹諾酮類藥物耐藥性中，拓撲異構酶IV 是首要靶位。

4.4 喹諾酮結構和靶酶的關系

在腸球菌選擇具體何種酶作為首要靶酶時，實際上與抗菌藥結構方面的關系十分密切，因此不同藥物結構作用的靶酶，也會存在一定差異[10]。 如左氧氟沙星主要靶酶為DNA 促旋酶；同樣有研究指出，環丙沙星在用于治療屎腸球菌時， 誘發ParC 基因突變的概率更高，說明主要靶酶拓撲異構酶IV。

5 藥物的排外特性

細菌細胞膜上有外排泵， 當人提服用藥物后，會有選擇地將藥物排出細胞外，因此細菌不至于被高濃度藥物殺死，確保細菌存活，這也是形成耐藥性的一大重要原因[11]。 而在相關研究中也發現，細胞的排外系統具有不同類型，例如根據能量形式和結構可以進行區分；另外也可以通過電化學質子梯度來外排藥物運轉系統。

在分析腸球菌時可發現， 該病菌具有外排系統，無論何種菌株，其主動排外現象均存在，這與藥物的低敏感度有很大關聯，其中也有研究證明，腸球菌敏感株對諾氟沙星等藥物具有主動外排能力[12]。

6 腸球菌的多重耐藥外排泵EmeA

細菌易化族類物質會介導病菌對喹諾酮類抗菌藥產生耐藥性，通常EmeA 蛋白會引起耐藥的不僅僅單純指喹諾酮類藥物，還包含多種結構上與之相似的無關藥物[13]。 在臨床中，通過將基因缺失菌株和基因互補株對諾氟沙星的MIC 值進行比較， 發現對諾氟沙的敏感性相較于野生株高兩倍。 丁月平等[14]人也研究了EmeA 的外排泵外排活性，通過將糞腸球菌的一條片段克隆到大腸艾希氏菌，經過測量顯示，這一片段還有兩個開放讀碼框， 其中之一便是emeA 基因，再將其克隆到大腸艾希氏菌上，發現耐藥性提高了四倍以上[15]。

7 腸球菌耐藥性預防

腸球菌和革蘭陽性菌不同，它對多種抗菌藥物具有固有或獲得耐藥機制，所以實際的耐藥情況十分復雜，例如對于青霉素等藥物的耐藥機制是由低親和力青霉素結合蛋白過量產生而使得細胞膜滲透力下降所致；反觀對于喹諾酮類抗菌藥，則由螺旋酶和拓撲異構酶IV 位點的改變，致使諾耐藥性產生[16]。 而有研究也表明，屎腸球菌和糞腸球菌對青霉素、環丙沙星的耐藥敏感率均高于70%，不過腸球菌對于氨基糖苷類抗生素表現出天然低水平耐藥，所以在臨床中也有學者提議，需要檢測腸球菌對于高濃度青大霉素以及鏈霉素等藥物的敏感性，以此來推測耐藥性；當然為了降低耐藥性，臨床中也主張聯合用藥[17]。 但是近年來，隨著耐藥腸球菌的感染者逐漸增多，且缺乏較為可靠的治療藥物，在未進一步做出深入研究前，臨床醫師仍然要嚴格控制抗生素使用，避免其引起醫院感染爆發。

綜上所述，目前在臨床中，腸球菌對于喹諾酮抗菌藥的耐藥性日漸提升，所以深入研究耐藥機制十分重要。 而據當前的研究發現，耐藥機制要么局限于靶酶突變，要么局限于藥物的主動排外。 在今后的研究中，應當將耐藥性、靶酶突變以及藥物主動排外相聯合，根據結構與功能間的關系，研究藥物與酶之間的相互作用。 在研究的同時也需要對喹諾酮類藥物進行深度開發，使之療效更加確切，同時成為同時作用于DNA 促旋酶和拓撲異構酶IV 的新型喹諾酮類抗菌藥。