LINC00052靶向miR-145發揮對TNF-α誘導人關節軟骨細胞損傷的保護作用

阿布都艾尼·熱吾提，周文正，車立新，徐江波，孫俊剛

(新疆維吾爾自治區人民醫院骨科中心創傷病區，新疆 烏魯木齊 830001)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)又稱骨關節病，是一類由關節軟骨基質的代謝平衡被打破而引發關節產生的退行性病變[1]。OA已經成為全球公共衛生的主要問題之一，隨著人類壽命的增加，預計在不久的將來OA的發病率會進一步增加，尤其是在中國等發展中國家[2]。OA好發于活動較頻繁的關節或負重關節，繁重的體力活動是造成OA的主要原因。OA病理表現為軟骨細胞數量減少、軟骨基質破壞及滑膜炎癥反應，臨床表現包括畸形、關節痛和功能障礙[3]。OA的發病由遺傳因素、機體免疫調控失衡和局部物理因素等長期作用所致，其確切的分子機制仍尚不清楚。OA治療包括藥物、外科手術及替代方案等，臨床上通常組合使用才能達到最佳效果[4]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸并缺乏編碼蛋白潛力的RNA[5]。研究表明，lncRNA參與多種生物學過程，例如細胞增殖和凋亡、細胞分化、腫瘤發生和轉移[6]。lncRNA的表達改變可導致與OA相關的多種基因及信號通路的異常表達，進而影響OA的進展[7-8]。盡管許多研究已經報道了LINC00052在一些腫瘤形成中的重要功能，但其在OA中的作用仍然未知。本研究通過采用一系列細胞功能實驗，分析LINC00052在TNF-α誘導人關節軟骨細胞損傷模型中的作用及機制，發現LINC00052靶向miR-145發揮對TNF-α誘導C-20/A4細胞損傷的保護作用。

1 資料與方法

1.1 材料 杜爾貝科改良伊格爾細胞培養基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、lipofectamine 2000轉染試劑、四唑鹽比色法[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、二甲基亞砜及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。LINC00052 shRNA、陰性對照(shRNA control)、miR-145抑制物(inhibitors)及抑制物對照(inhibitors control)購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。LINC00052野生型(LINC00052-wt)和突變型報告基因載體(LINC00052-mut)購自上海吉凱基因化學技術有限公司。蛋白提取及定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。一抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase 3，CASP3)、cleaved CASP3、Bcl-2相關X(Bcl-2 associated X，BAX)蛋白及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體]和二抗(抗兔和鼠HRP抗體)購自美國Abcam公司。白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和IL-13酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國Proteintech公司。TRIzol、逆轉錄及實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒購自日本Takara公司。LINC00052、GAPDH、miR-145及U6引物購自上海生工生物工程有限公司。人C-20/A4關節軟骨細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 TNF-α誘導建立人C-20/A4關節軟骨細胞損傷模型 C-20/A4細胞復蘇后，采用DMEM細胞培養基和10%加熱滅活的胎牛血清培養，并添加100 μg/mL青霉素和鏈霉素抑制細菌生長。常規傳代與接種，當細胞傳至3～5代后，取生長狀態良好的C-20/A4細胞接種至6孔板(約5×106個/孔)，每組設置3個復孔。培養24 h后，分別將0、10及30 ng/mL TNF-α添加至各組細胞，繼續放置培養箱中培養48 h，之后收集細胞并檢測炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-13濃度的變化，確定建模是否成功。

1.2.2 RT-qPCR 收集1×106個C-20/A4細胞，采用TRIzol試劑盒按照操作要求從細胞中提取總RNA，檢測RNA濃度，并進行逆轉錄實驗合成cDNA。RT-qPCR反應體系為20 μL，包括cDNA模版1 μL，Premix Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，無RNA酶去離子水8 μL。LINC00052擴增步驟為：98℃ 10 min，隨后98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環。人LINC00052上游引物：5’-CCTGAAGTTT CTCCATGAATTGTG-3’；下游引物：5’-GAGGGAGGGAGACTGAGATT-3’；以GAPDH為內參，上游引物：5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’；下游引物：5’-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3’。人miR-145擴增步驟為：95℃10 min，隨后98℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環。miR-145上游引物：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；下游引物：5’-AGGTCCAGTTTTCCCAGG-3’；以U6為內參，上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5’。

1.2.3 細胞轉染 C-20/A4細胞接種至6孔板(約5×106個/孔)，每組設置3個復孔。放置于37℃培養箱中培養過夜，待融合度達到70%～80%時，采用lipofetamine2000轉染2.5 μg LINC00052 shRNA和shRNA control或150 pmol miR-145 inhibitors和inhibitors control至C-20/A4細胞。待轉染48 h后收集各組細胞，采用RT-qPCR分析各組LINC00052和的miR-145的表達。

1.2.4 蛋白質印跡 收集1×106個C-20/A4細胞，在4℃下提取總蛋白并測定蛋白濃度。105℃下加熱2 min使蛋白充分變性。常規配置蛋白分離膠與濃縮膠，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白并轉移到聚偏氟乙烯膜上。之后，將膜用5%脫脂奶粉在37℃下封閉2 h，然后用抗CASP3、cleaved CASP3、BAX及GAPDH抗體孵育并在4℃過夜。用三羥甲基氨基甲烷-Tween緩沖鹽水(triethanolamine buffered saline-Tween solution，TBS-T)緩沖液洗滌3次，每次5min，將膜與合適的二抗在37℃下孵育1 h。使用增強化學發光顯色試劑盒進行蛋白條帶檢測，以GAPDH蛋白當作為內參對照。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗 C-20/A4細胞接種至24孔板(約3×104個/孔)，每組設置3個復孔，并放置于37℃培養箱中培養過夜。待每孔細胞融合度達70%～80%時，采用lipofetamine2000轉染0.5 μg LINC00052-wt和LINC000

52-mut，同時轉染20 pmol miR-145 inhibitors和inhibitors control至C-20/A4細胞。6 h后更換新鮮培養基，放置37℃培養箱中繼續培養48 h，離心收集各孔細胞。裂解細胞并收集上清液，測定各組螢火蟲及海腎熒光值，并計算相對熒光素酶比值(海腎熒光值/螢火蟲熒光值)。

1.2.6 MTT C-20/A4細胞接種至96孔板(5×103個/孔)，每組設置3個復孔，培養過夜。細胞轉染0、24、48和72 h后，向每組中加入12 μL MTT(5mg/mL)，培養4 h，再向每組中加入200 μL二甲基亞砜溶解結晶。在室溫下用搖床振蕩15 min，用酶標儀測量每組樣品490 nm處的光密度(optical density，OD)。以培養時間為橫坐標，OD為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.2.7 ELISA 收集1×106個C-20/A4細胞，在4℃下提取總蛋白。采用ELISA試劑盒處理各組蛋白，并添加至96孔板中。用酶標儀測量每組樣品在450 nm波長處的OD，繪制標準曲線，并分別計算IL-1β、IL-6和IL-13的濃度。

1.2.8 生物信息學分析 使用Starbase2.0(http：//starbase.sysu.edu.cn/starbase2/index.php)和miRcode(http：//www.mircode.org/)數據庫預測LINC00052的靶基因。

2 結 果

2.1 TNF-α誘導人關節軟骨細胞損傷模型中LINC00052與miR-145表達分析 ELISA結果顯示，10 ng/mL TNF-α誘導組C-20/A4細胞中IL-1β、IL-6和IL-13的濃度分別是0 ng/mL TNF-α誘導組的(1.79±0.22)、(2.50±0.27)及(1.24±0.13)倍，差異有統計學意義(見圖1a，P<0.05)。30 ng/mL TNF-α誘導組C-20/A4細胞中IL-1β、IL-6和IL-13的濃度分別是10 ng/mL TNF-α誘導組的(2.03±0.28)、(3.29±0.41)及(1.80±0.24)倍，差異有統計學意義(見圖1b，P<0.05)。RT-qPCR結果顯示，0 ng/mL、10 ng/mL及30 ng/mLTNF-α誘導組C-20/A4細胞中LINC00052的相對表達水平分別為(1.0±0.11)、(1.91±0.16)及(4.84±0.35)，而miR-145的相對表達水平分別為(1.0±0.14)、(0.86±0.12)及(0.17±0.05)，差異有統計學意義(見圖1c，P<0.05)。TNF-α誘導人C-20/A4關節軟骨細胞損傷模型中，LINC00052與miR-145的表達水平呈負相關(見圖1d，P<0.05)。

2.2 LINC00052 shRNA和miR-145 mimics轉染效率分析 RT-qPCR結果顯示，C-20/A4細胞轉染shRNA control與LINC00052 shRNA后，LINC00052的相對表達水平分別為(1.0±0.15)與(0.38±0.06)，差異有統計學意義(見圖2a，P<0.05)。C-20/A4細胞轉染inhibitors control與miR-145 inhibitors后，miR-145的相對表達水平分別為(1.0±0.18)與(0.23±0.05)，差異有統計學意義(見圖2b，P<0.05)。

a 炎癥因子濃度在0與10ng/mL TNF-α誘導組比較 b 炎癥因子濃度在10與30ng/mL TNF-α誘導組比較 c LINC00052與miR-145相對表達水平分析 d LINC00052與miR-145表達相關性分析

a LINC00052相對表達水平分析 b miR-145相對表達水平分析

2.3 干擾LINC00052對TNF-α誘導人關節軟骨細胞損傷模型中細胞增殖、凋亡及炎癥反應的影響 MTT結果顯示，shRNA control組C-20/A4細胞中24、48及72 h OD分別為(0.27±0.02)、(0.52±0.04)及(0.92±0.05)，而LINC00052 shRNA組中24、48及72 h OD分別為(0.20±0.03)、(0.38±0.03)及(0.59±0.04)，差異有統計學意義(見圖3a，P<0.05)。蛋白質印跡結果顯示，LINC00052 shRNA組C-20/A4細胞中CASP3、cleaved CASP3及BAX蛋白的相對表達水平分別是shRNA control組的(1.88±0.24)、(2.42±0.26)及(3.91±0.33)倍，差異有統計學意義(見圖3b，P<0.05)。ELISA結果顯示，LINC00052 shRNA組C-20/A4細胞中IL-1β、IL-6和IL-13濃度分別是shRNA control組的(3.05±0.46)、(2.77±0.34)及(2.45±0.20)倍，差異有統計學意義(見圖3c，P<0.05)。

2.4 LINC00052直接負性調控miR-145的表達 生物信息學分析顯示，LINC00052中5’-AACUGGA-3’序列可與miR-145中3’-UUGACCU-5’序列特異性結合(見圖4a)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，C-20/A4細胞轉染LINC00052-wt后inhibitors control與miR-145 inhibitors組中相對熒光素酶比值分別為(1.0±0.29)與(5.17±0.46)，差異有統計學意義(P<0.05)；而轉染LINC00052-mut后inhibitors control與miR-145 inhibitors組中相對熒光素酶比值分別為(1.0±0.18)與(1.03±0.22)，差異無統計學意義(見圖4b)。RT-qPCR結果顯示，C-20/A4細胞轉染shRNA control與LINC00052 shRNA后，miR-145的相對表達水平分別為(1.0±0.16)與(2.62±0.24)，差異有統計學意義(見圖4c，P<0.05)。C-20/A4細胞轉染LINC00052 shRNA后，inhibitors control與miR-145 inhibitors組中miR-145的相對表達水平分別為(1.0±0.14)與(0.84±0.10)，差異有統計學意義(見圖4d，P<0.05)。

2.5 干擾miR-145部分逆轉LINC00052抑制對TNF-α誘導C-20/A4細胞增殖、凋亡及炎癥反應的影響 MTT結果顯示，C-20/A4細胞轉染LINC00052 shRNA后inhibitors control組24、48及72 h OD值分別為(0.22±0.02)、(0.35±0.03)及(0.67±0.05)，而miR-145 inhibitors組中24、48及72 h OD值分別為(0.28±0.03)、(0.44±0.04)及(0.80±0.06)，差異有統計學意義(見圖5a，P<0.05)。蛋白質印跡結果顯示，miR-145 inhibitors組C-20/A4細胞中CASP3、cleaved CASP3及BAX蛋白的相對表達水平分別是inhibitors control組的(0.90±0.15)、(0.12±0.06)及(0.31±0.10)倍，差異有統計學意義(見圖5b，P<0.05)。ELISA結果顯示，miR-145 inhibitors組C-20/A4細胞中IL-1β、IL-6和IL-13濃度分別是inhibitors control組的(0.62±0.10)、(0.37±0.08)及(0.71±0.15)倍，差異有統計學意義(見圖5c，P<0.05)。

3 討 論

越來越多的研究表明，大量lncRNA在OA軟骨細胞中呈差異表達[9-10]。目前已經發現，一些lncRNA在OA中參與多種病理過程，包括細胞外基質降解、炎癥反應、細胞增殖與凋亡和血管生成[11-13]。例如，分化拮抗非蛋白質編碼RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR)在OA軟骨細胞中表達上調，干擾DANCR表達抑制細胞增殖并誘導凋亡[14]。叉頭蛋白D2相鄰相反鏈RNA1(forkhead box D2 adjacent opposite strand RNA 1，FOXD2-AS1)在OA軟骨細胞中表達上調，過表達FOXD2-AS1促進細胞增殖，而抑制FOXD2-AS1誘導細胞周期G0/G1期阻滯，并且促進細胞凋亡[15]。軟骨損傷的相關RNA(cartilage injury-related RNA，CIR)在OA軟骨細胞中高表達并通過調節自噬促進關節軟骨退化[16]。此外，漿細胞瘤變異易位1(plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)在OA軟骨細胞中表達上調并在IL-1β誘導OA軟骨細胞中引起代謝功能障礙和炎癥反應改變[17]。軟骨細胞是與軟骨結構和功能相關的特殊細胞。軟骨細胞增殖與凋亡的異常和炎癥反應改變可能是導致OA軟骨降解的主要原因之一[18]。TNF-α被認為是與OA發病相關的關鍵促炎因子，TNF-α可在體外誘導軟骨細胞炎性損傷[19]。因此，開發抑制TNF-α誘導的軟骨細胞損傷的新型靶向藥物可能有助于改善OA。

a 細胞增值曲線 b CASP3、cleaved CASP3及BAX蛋白表達水平分析 c IL-1β、IL-6和IL-13濃度分析

a 細胞增值曲線 b CASP3、cleaved CASP3及BAX蛋白表達水平分析 c IL-1β、IL-6和IL-13濃度分析

a LINC00052與miR-145結合位點預測圖 b 雙熒光素酶報告基因實驗 c 干擾LINC00052對miR-145表達的影響 d 同時干擾LINC00052與miR-145對miR-145表達的影響

LINC00052定位于人第15號染色體長臂2區5帶3亞帶，包含3個外顯子，由1 786個核苷酸組成。LINC00052是一種新發現的與癌癥發展有關的lncRNA。LINC00052激活人表皮生長因子受體3(hairy-related 3，HER3)和Wnt/β-Catenin信號通路分別促進乳腺癌和胃癌進展[20-21]。然而，在胰腺癌和結直腸癌中，LINC00052被證明具有抑癌作用[22-23]。目前，關于LINC00052在OA中的生物學功能缺乏相關的報道。本研究通過TNF-α誘導成功建立人C-20/A4關節軟骨細胞損傷模型來模擬OA的病理過程，發現LINC00052在0 ng/mL、10 ng/mL及30 ng/mL TNF-α誘導C-20/A4細胞中的表達水平呈上調趨勢。鑒于LINC00052在腫瘤中的關鍵作用，因此我們推測表達上調的LINC00052在OA中亦具有重要作用。進一步采用細胞功能實驗發現，干擾LINC00052降低TNF-α誘導C-20/A4細胞增殖能力，增加CASP3、cleaved CASP3及BAX的蛋白表達水平，并提高IL-1β、IL-6及IL-13的濃度。該結果表明，LINC00052對TNF-α誘導人關節軟骨細胞損傷具有保護作用。

眾所周知，lncRNA通過修飾DNA結構，RNA轉錄和蛋白質翻譯來調控生物學過程[24]。競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)機制是近年來發現的一種新的lncRNA調控機制。在這個機制中，lncRNA直接與靶標微小RNA(microRNA，miRNA)結合抑制其表達水平，從而影響疾病進展[25]。據報道，在腫瘤中LINC00052可通過ceRNA機制負調控多種miRNA，包括miR-574-5p、miR-452-5p、miR-330-3p及miR-608[22-23，26-27]。最近的研究證實，miR-145在調節炎癥反應中起著至關重要的作用[28]。此外，研究者還發現腫瘤中miR-145的下調會促進細胞增殖并抑制凋亡[29]。我們的研究表明，miR-145在0 ng/mL、10 ng/mL及30 ng/mL TNF-α誘導C-20/A4細胞中的表達水平呈下調趨勢，并與LINC00052表達呈負相關。雙熒光素酶報告基因實驗發現，miR-145是LINC00052的直接靶基因，干擾LINC00052上調C-20/A4細胞中miR-145的表達水平。與以前的研究一致，干擾miR-145部分逆轉LINC00052抑制對TNF-α誘導C-20/A4細胞增殖、凋亡及炎癥反應的影響。該結果表明，LINC00052靶向miR-145發揮對TNF-α誘導人關節軟骨細胞損傷的保護作用。

總之，LINC00052在TNF-α誘導人關節軟骨細胞損傷模型中表達下調。LINC00052直接負性調控miR-145的表達。LINC00052靶向miR-145發揮對TNF-α誘導人關節軟骨細胞損傷的保護作用，其機制可能與促進增殖并抑制凋亡與炎癥反應有關。