Toll樣受體-4、9基因多態性與胃癌發病風險的相關性研究*

周 琳，張青松，朱燕忠，趙吉光，顧園園△

1.前海人壽廣州總醫院檢驗科，廣東廣州 511330；2.江蘇省太湖康復醫院檢驗科，江蘇無錫 214086； 安徽宣城市中心醫院：3.檢驗科；4.腫瘤科，安徽宣城 242000

胃癌是我國發病率及病死率較高的惡性腫瘤之一。目前研究普遍認為環境因素與遺傳因素交互作用導致疾病的進展并最終導致胃癌的發生，其中環境因素如飲食結構與習慣、吸煙、飲酒等被認為是胃癌的誘發因素，病原菌感染如幽門螺桿菌(Hp)、EB病毒感染是胃癌的致病因素[1]。這些易感因素的探明為胃癌的預警及重點人群的早期篩查提供了重要依據[2]。Toll樣受體(TLR)是一種進化上高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表達于巨噬細胞和樹突細胞表面，其是一組重要的模式識別受體，在病原體入侵人體時發揮屏障作用。TLR-4與病原體入侵機體的早期免疫應答及感染后的適應性免疫應答相關。研究表明TLR-4是細菌脂多糖的受體，Hp脂多糖可以通過TLR-4誘導致炎因子分泌，通過活化單核細胞和胃上皮細胞誘導一氧化氮和氧自由基，導致胃部炎癥及疾病進展[3]。因此，TLR-4與腫瘤特別是炎癥相關性腫瘤密切相關。TLR-9主要表達于多種免疫細胞，如記憶性B淋巴細胞、T細胞、漿細胞樣樹突細胞等，其在多種腫瘤細胞中亦有表達；在胃癌的發生過程中TLR-9介導的炎性反應發揮著重要的作用[4]。有研究指出，TLR-9基因多態性與Hp感染相關，是胃癌潛在易感基因[5]。本研究對江蘇省無錫市及安徽省宣城市胃癌及健康人群進行調查，探討TLR-4及TLR-9基因多態性與胃癌發病風險及病理的相關性，為胃癌的臨床及基礎研究積累分子流行病學資料，探討其臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年12月招募江蘇省無錫市及安徽省宣城市經病理確診的325例胃癌患者(病例組)，以及同期招募該地區經體檢檢測結果為健康且自述無消化道疾病史的健康者402例(對照組)作為研究對象。

1.2方法 所有受試者均采集乙二胺四乙酸抗凝的靜脈血3 mL，分離血漿與血細胞。Hp感染采用膠體金法(上海凱創生物技術公司產品)檢測抗體?；蚪MDNA提取采用納米磁技術(西安金磁納米生物技術有限公司產品)按照試劑說明書步驟進行。基因組提取后檢測DNA濃度與純度(NaniDrop2000c型蛋白核酸檢測儀，美國Thermo公司)?；蚍中筒捎肕assARRAY技術進行(點樣儀及質譜儀為美國Sequenom公司產品；Iplex Gold Reagent kit試劑盒為美國Sequenom公司產品)，該平臺分析基因型主要為以下步驟：目標序列的擴增、蝦堿性磷酸酶純化、單堿基延伸、樹脂純化、MassArray點樣儀、質譜分析、結果解讀。PCR所用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增儀為美國ABI公司產品(GeneAmp PCR System 9700型)。

1.3多態性位點的選擇 在公共數據庫中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)檢索TLR-4及TLR-9基因多態性位點的信息?；蚨鄳B性位點的選擇符合以下條件：(1)現有研究顯示有潛在的胃癌相關性風險；(2)基因多態性位點在中國人群的最小等位基因頻率為大于0.05；(3)基因多態性位點位于TLR-4或TLR-9基因相關區域位置見表1。

表1 TLR-4及TLR-9基因多態性位點信息

2 結 果

2.1兩組臨床與基本特征比較 兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)；病例組中吸煙、飲酒比例高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組的Hardy-Weinberg 遺傳平衡(HWE)檢驗結果(P>0.05)顯示樣本具有群體代表性，見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2兩組TLR-4、TLR-9基因多態性位點的基因型分布及與胃癌發病風險的關系 TLR-9 rs187084基因多態性位點的GA、GA/GG基因型與胃癌發病風險相關，見表3。

表3 兩組TLR-4、TLR-9基因多態性位點的基因型分布及與胃癌發病風險的關系

續表3 兩組TLR-4、TLR-9基因多態性位點的基因型分布及與胃癌發病風險的關系

2.3TLR-9 rs187084基因多態性位點的基因型與胃癌發病風險的相關因素分析 為明確TLR-9 rs187084基因多態性位點的基因型與胃癌發病風險的相關因素之間關系，對年齡、性別、Hp感染、腫瘤部位、腫瘤分期進行分析，結果顯示年齡>60歲的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多態性位點的GA及GA/GG基因型均與胃癌發病風險相關(P<0.05)，年齡≤60歲胃癌患者的TLR-9 rs187084基因多態性位點的所有基因型均與胃癌發病風險無關。病例組Hp感染陽性患者的TLR-9 rs187084基因多態性位點的GA及GA/GG基因型均與胃癌發病風險相關(P<0.05)，而病例組Hp感染陰性患者的TLR-9 rs187084基因多態性位點的所有基因型均與胃癌發病風險無關。腫瘤部位為非賁門的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多態性位點的GA及GA/GG基因型均與胃癌發病風險相關(P<0.05)。胃癌患者腫瘤分期T3～T4期患者的TLR-9 rs187084基因多態性位點的GA及GA/GG基因型與胃癌發病風險相關(P<0.05)，見表4。

表4 兩組TLR-9 rs187084基因多態性位點的基因型與胃癌發病風險的相關因素分析

3 討 論

TLR-9 rs187084位點位于該基因的啟動子-1 486位，該位點的多態性導致形成轉錄因子SP1的結合位點[6]，影響了TLR-9表達[7]。研究顯示，與淺表性胃炎、萎縮性胃炎及異常增生的患者相比，TLR-9在胃癌患者中呈現高表達，且與Hp感染相關[4，8]。有研究表明，在宮頸癌研究中發現該位點與患者外周血單核細胞中的TLR-9 mRNA及血清中的TLR-9蛋白水平相關，并與人乳頭瘤病毒感染關聯[9]。本研究結果顯示，TLR-9 rs187084基因多態性位點的GA及GA/GG基因型與胃癌發病風險相關。此外，另有研究進一步證實GA 或GG基因型與胃癌、宮頸癌發病風險相關[10-11]，與本研究結果一致。

本研究發現年齡>60歲的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多態性位點的GA及GA/GG基因型均與胃癌發病風險相關(P<0.05)，可能是由于在年齡較大的人群中受到Hp持續感染，暴露時間長，致胃部炎癥水平升高，引起TLR-9表達增加，進而增加胃癌的發病風險[12]。胃癌患者腫瘤部位為非賁門的患者TLR-9 rs187084基因多態性位點的GA及GA/GG基因型均與胃癌發病風險相關(P<0.05)，與TLR-9參與胃癌的發病進程相關機制一致[12]。有研究顯示，TLR-9 rs187084基因多態性位點的基因型與胃癌的預后相關，G等位基因與預后較差相關[10]，此與本研究結論一致。本研究結果顯示，TLR-9 rs187084基因多態性與胃癌發病風險相關，且與Hp感染有潛在關聯，是非賁門胃癌的風險因素，該位點的基因型與胃癌的分期相關，是潛在的預后不良因素。

有研究發現TLR-4 rs10759932基因多態性位點[14]及rs1927911基因多態性位點[15]的基因型與胃癌發病風險相關，與本研究的結論不一致。此可能與病例選擇及研究的方法不一樣有關，上述兩個研究均采用聚合酶鏈反應-限制性內切酶法，而本研究采用的Mass-array基因分析平臺結果相對可靠。還有研究顯示TLR-4 rs11536889 的基因型與胃癌發病風險相關[16]，與本研究結論不一致，其所納入病例相對較少，而本研究病例數雖相對較大，但本研究的病例數統計學效應還較弱，有待于更多的大樣本研究進一步證實。胃癌是一個多基因多因素參與的復雜疾病，TLR-9 rs187084基因多態性位點的功能研究還不清晰。

綜上所述，年齡>60歲及非賁門部位的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多態性位點的GA及GA/GG基因型均與胃癌發病風險相關。