胃癌患者血清中miRNA-181s表達與幽門螺桿菌感染的關系

張 敏，蔡灼遠，于 莉

儋州市人民醫院檢驗科，海南儋州 571700

胃癌是我國常見的癌癥之一,其發生、發展涉及多種因素，幽門螺桿菌(Hp)感染被世界衛生組織(WHO)列為Ⅰ類致癌原，已有大量研究證實其與胃癌的發生、發展關系密切[1-2]。Hp感染損傷胃黏膜屏障，引起的胃部炎性反應，影響細胞內信號通路刺激上皮細胞增殖及修復，誘導上皮細胞發生惡性轉化[3-4]。另外，近年來大量研究指出微小RNA(miRNA)的異常表達與腫瘤的發生、發展、轉移等有關[5-6]。miRNA是一類高度保守的短鏈RNA，通過與靶標mRNA 3′端非翻譯區的結合來調節多種細胞變化過程。Hp感染可引起miRNA表達水平的變化，從而影響胃黏膜的炎性反應、免疫應答及癌基因或抑癌基因的表達，進而參與消化道疾病的發生和發展[7]。miRNA-181s家族是備受關注的miRNA之一，主要包括miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d。有研究發現異常表達的miRNA-181c參與Hp相關胃癌的發生、發展[8]。miRNA-181s家族中其他成員在胃癌中的表達水平Hp感染的相關研究甚少。因此，本文旨在通過檢測胃癌患者血清中miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d的表達水平，并探討其與Hp感染的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年1月至2020年6月收治的胃癌患者50例作為觀察組，其中男性28例、女性22例，平均年齡(56.84±6.05)歲。納入標準：(1)均經胃鏡病理證實為胃腺癌，且均為首次診斷為胃癌；(2)近3個月未規律服用過抑酸藥、胃黏膜保護劑、非甾體類抗炎藥、抗菌藥物。排除標準：(1)合并其他器官原發腫瘤；(2)合并免疫系統疾病；(3)重要器官(肝、腎等)功能不全；(4)有惡性腫瘤家族遺傳史；(5)接受過放療、化療、生物治療等。選取同期在本院體檢的健康人群50例作為對照組，其中男性25例、女性25例，平均年齡(57.58±6.16)歲。

1.2儀器與試劑 熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 96)為瑞士Roche公司產品。多功能酶標儀(Infinite M1000 PRO)為瑞士Tecan公司產品。U6、miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d引物購自上海生工生物科技有限公司。逆轉錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kitmirPremier?microRNA Isolation Kit)、實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green PCR Master Mix)、磷酸化信號傳導子及轉錄激活子3(p-STAT3)檢測試劑盒、白細胞介素-6(IL-6)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3方法

1.3.1尿素14C呼氣試驗檢測Hp感染 采用尿素14C呼氣試驗檢測Hp感染情況,受試者空腹或禁食2 h以上，漱口后口服尿素14C膠囊1粒，靜坐25 min，開啟CO2集氣瓶1瓶，插入潔凈的有防倒流裝置的氣體導管，受試者通過導管吹氣，當CO2集氣劑由紫紅色變為無色時停止吹氣，用潔凈管向樣品瓶內加入稀釋閃爍液4.5 mL，加蓋密封，溶解搖勻后于液閃儀上行樣品14C放射性測定3 min。按公式計算結果，當尿素14C呼氣試驗結果(14C-UBT)≥100 dpm/mmol CO2時，判定受試者為Hp陽性。

1.3.2血清標本采集 所有研究對象于檢查后抽取空腹靜脈血6 mL，于2 h內在室溫條件下經3 000 r/min離心15 min，留取上層清液(約3 mL)作為標本，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3實時熒光定量PCR法檢測血清miRNA-181s 取血清加入細胞裂解液進行裂解后，根據總RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA。利用逆轉錄試劑盒以RNA為模板逆轉錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增。反應程序設置為 95 ℃ 5 min，預變性；95 ℃ 30 s，40個循環；57 ℃ 30 s，延伸。用2-ΔΔCt法計算血清miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.4酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清IL-6和p-STAT3表達水平 根據IL-6和p-STAT3檢測試劑盒說明書進行檢測，具體步驟如下：取出試劑盒板條室溫平衡20 min；標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL，樣本孔加入待測樣本50 μL；隨后每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min；洗板機洗板5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內，在450 nm波長處測定各孔的吸光度，計算各樣本濃度值。

2 結 果

2.1Hp感染檢測結果 觀察組Hp陽性患者34例，Hp陰性患者16例，Hp感染率68%；對照組Hp陽性患者16例，Hp感染率為32%，觀察組Hp感染率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。觀察組Hp感染檢測結果見表2。

表2 觀察組Hp感染檢測結果(n)

2.2兩組外周血中miRNA-181s相對表達水平比較 觀察組miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d相對表達水平分別為3.84±0.42、6.29±0.89、5.02±0.51和4.88±0.32，均高于對照組中相應的miRNA相對表達水平(分別為1.11±0.19、1.03±0.16、1.07±0.11和1.02±0.10)，差異有統計學意義(t1=32.49、t2=62.58、t3=47.06、t4=45.97，P<0.05)。

2.3觀察組Hp陽性與陰性患者血清中miRNA-181s相對表達水平比較 觀察組Hp陽性患者血清中miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d相對表達水平分別為4.05±0.33、6.76±0.65、5.26±0.43和5.03±0.28；Hp陰性患者血清中miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d相對表達水平分別為3.39±0.17、5.29±0.22、4.52±0.21和4.58±0.12。觀察組Hp陽性患者miRNA-181s相對表達水平均明顯高于Hp陰性患者，差異有統計學意義(t1=7.449、t2=8.828、t3=6.478、t4=6.060，P<0.05)。見圖1。

注：與Hp陰性患者比較，**P<0.05；A為miRNA-181a相對表達水平,B為miRNA-181b相對表達水平,C為miRNA-181c相對表達水平,D為miRNA-181d相對表達水平。

2.4Hp感染與IL-6/p-STAT3表達水平的關系 觀察組Hp陽性患者和Hp陰性患者血清中IL-6表達水平分別為(717.43±121.57)pg/mL和(531.24±74.68)pg/mL，差異有統計學意義(t=5.629，P<0.05)。觀察組Hp陽性患者和Hp陰性患者血清中p-STAT3表達水平分別為(14.15±0.90) ng/mL和(12.03±0.87)ng/mL，差異有統計學意義(t=7.804，P<0.05)。

3 討 論

miRNA功能較多，其具有調控促癌基因表達、發揮促進惡性腫瘤發生的作用，以及調控抑癌基因表達、發揮抑制惡性腫瘤發生的作用[9]。目前，已經發現約650個miRNA與腫瘤的發生密切相關[10]。miRNA-181s在細胞增殖、凋亡、分化與耐藥等過程中起到重要的作用[11-15]。ZHANG等[16]推測miRNA-181a可能通過轉錄后基因沉默機制使KLF6蛋白表達下降,從而促進胃癌的發生、發展。涂龍霞[17]指出miRNA-181a通過在轉錄后抑制TGFβR2蛋白表達來促進胃癌細胞的遷移和增殖。高楠等[18]研究指出miRNA-181b可靶向調控NDRG2的表達從而調控SGC-7901細胞的侵襲遷移能力。有研究指出miRNA-181c可能通過甲基化被沉默，并通過其靶基因NOTCH4和KRAS在胃癌發生中發揮重要作用[19]。安娟等[20]研究指出胃癌患者血清中miRNA-181d表達較高且通過作用于PDCD43′-UTR區發揮生物功能。姚育紅等[21]研究指出在人胃癌細胞系中miRNA-181a和miRNA-181b表達均上調。本研究結果顯示，與對照組比較，觀察組血清中miRNA-181s表達均上調；與Hp陰性患者相比，觀察組Hp陽性患者血清中miRNA-181s表達均上調且以miRNA-181b上調最為明顯。Hp感染可導致胃黏膜組織中某些miRNA異常表達，從而引起某些原癌基因、抑癌基因及其相應的信號傳導通路障礙，繼而影響胃癌的發生、發展[22]。有研究發現，在Hp感染的胃黏膜組織中，有17個差異表達的miRNA與慢性胃炎和促炎癥細胞因子具有相關性[23]。miRNA-21是第1個被發現受Hp感染影響的miRNA[24]。SAITO等[25]指出Hp感染可能通過miRNA-181b激活IL-6/STAT3信號途徑，進而抑制尾型同源盒轉錄因子表達和p53信號通路，導致胃癌預后不良。為了進一步探討miRNA-181s的作用機制，本研究同時檢測了患者血清中IL-6和p-STAT3的表達水平，結果顯示miRNA-181s可能通過胃癌的發生、發展調控IL-6/STAT3信號途徑，影響胃癌的進展。

綜上所述，胃癌患者血清miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c、miRNA-181d水平升高，與Hp感染有關，且可能通過IL-6/p-STAT3信號途徑影響胃癌的發生、發展，從而為胃癌的防治提供一定的理論基礎。