京尼平苷通過AMPK/mTOR通路抑制帕金森模型氧化應激及細胞凋亡的機制研究

朱 寧，馬曉珊，陳春麗，黎國仙，楊秀娟，謝 東*

(1.南方醫科大學南海醫院藥學科，廣東 佛山 528244；2. 南方醫科大學珠江醫院藥學部，廣東 廣州 510282)

帕金森疾病(Parkinson′s disease,PD)是目前世界排名第二的神經元變性疾病，已嚴重危及老年人的生命健康[1]。目前PD的臨床治療主要為多巴胺替代治療，如左旋多巴能夠在一定程度上減輕PD患者的癥狀，但其并不能夠阻止疾病的進程，且治療時患者會對藥物的敏感性降低[2-3]。因此，亟待探尋新的藥物研發以減緩PD疾病進程。京尼平苷(geniposide,GP)的主要藥效成分為中藥梔子。有研究顯示其能夠透過用于阿爾茨海默病的治療，并能夠通過哺乳動物雷帕霉素靶點(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路發揮神經保護作用[4-6]。自噬是依賴溶酶體體內異常蛋白以及受損細胞器降解的一種分解機制。研究證實細胞自噬途徑的調控異常，例如磷酸腺苷依賴的蛋白激酶/mTOR(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase/mTOR,AMPK/mTOR)信號通路調控，在PD疾病進展中發揮著重要的作用[7-8]。但是目前關于GP是否能夠通過調控AMPK/mTOR信號通路來發揮抑制帕金森模型氧化應激損傷、細胞凋亡及自噬的作用還尚不清楚。本研究使用1-甲基4-苯基-四氫吡啶離子(1-methyl-4-phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPP+)預處理人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞構建PD細胞模型，探究GP對PD細胞模型的細胞凋亡、氧化應激損傷及自噬的影響，并進一步探究GP是否通過AMPK/mTOR信號通路調控PD細胞模型的細胞凋亡及自噬。

1 材料與方法

1.1材料 人神經母細胞瘤株SH-SY5Y購自于上海中科院細胞庫。MPP+、兔抗AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、LC3B單克隆抗體、大鼠抗β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔與兔抗大鼠二抗均購自于美國Sigma公司；胎牛血清、胰酶、青鏈霉素混合液及RPMI 1640培養基均購自于美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒及BCA蛋白檢測試劑盒購自于英國Abcam公司；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性檢測試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒及購自于北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自于美國Invitrogen公司；Efficient chemiluminescence(ECL)化學發光顯色試劑盒購自于美國Millipore公司；AMPK激動劑Metformin及mTOR抑制劑Rapamycin購自于美國Cell signaling technology公司；京尼平苷(≥98%)購自于成都錦泰和醫藥化學技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將SH-SY5Y細胞置于含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640培養基中，在5% CO2條件下的37 ℃恒溫培養箱中常規培養。用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀況，每3～4 d更換一次培養基。待細胞匯合度達80%左右時，1∶3胰酶消化傳代，取3～7代生長狀況良好的細胞用于后續試驗。

1.2.2篩選最適MPP+濃度及作用時間以建立急性PD細胞損傷模型 取適量MPP+溶于細胞培養液中，終濃度調整為1 mmol/L，0.22 μm孔徑濾膜過濾除菌，置于4 ℃冰箱保存備用。取處于指數生長期的SH-SY5Y細胞，調整細胞密度，按1×104個/孔接種于96孔板中，常規培養12 h，取不同終濃度(0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L)的MPP+添加至細胞培養板中作用24 h，及1 mmol/L MPP+添加至細胞培養板中作用不同時間(0 h、6 h、12 h、24 h及48 h)，按照CCK-8試劑盒說明書添加試劑后，使用酶標儀于450 nm波長處檢測不同濃度MPP+處理后細胞的吸光度，以0 mmol/L為對照，計算分析細胞活力。

1.2.3試驗分組及處理 ①對照(Control)組：正常培養的SH-SY5Y細胞，無任何特殊處理；②MPP+組：單獨使用1 mmol/L MPP+進行處理的SH-SY5Y細胞；③GP 組：根據預試驗結果，單獨使用100 μmol/L GP進行處理SH-SY5Y細胞；④MPP+聯合GP處理組(MPP++GP)：使用1 mmol/L MPP+進行SH-SY5Y細胞的預處理，培養24 h后添加100 μmol/L GP。

上述各組細胞均置于5% CO2條件下的37 ℃恒溫培養箱中培養， 48 h后進行后續相關實驗。此外，分別采用AMPK激動劑Metformin(Met)及mTOR抑制劑Rapamycin(Rap)處理MPP+組及MPP++GP組，明確GP是否通過AMPK/mTOR通路影響MPP+誘導的SH-SY5Y細胞的增殖及自噬能力。

1.2.4CCK-8法測定細胞活性 將各組細胞按照1×104個/孔接種于96孔板中，置于細胞培養箱中常規培養24 h；待檢測前4 h棄去細胞培養基，使用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌3次，每孔加入10 μL 細胞計數試劑(cell counting kit-8,CCK-8)混勻，置于培養箱中孵育4 h，使用酶標儀于450 nm處檢測細胞吸光度，計算分析細胞的增殖活性。實驗重復3次。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，將細胞密度調整為5×105/mL，使用預冷磷酸緩沖液漂洗細胞，加入100 μL Binding buffer溶液重懸細胞，隨后依次加入5 μL Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)及10 μL 碘化丙啶染色液(propidium iodide,PI)，于室溫條件下避光染色處理15 min，隨即上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。實驗重復3次。

1.2.6氧化應激指標檢測 收集上述待測細胞，取細胞培養上清液，分別按照LDH試劑盒、SOD試劑盒及MDA試劑盒說明書操作檢測細胞的LDH表達、SOD活性以及MDA含量。實驗重復3次。

1.2.7LC3蛋白定位 將生長條件良好的SH-SY5Y細胞，調整細胞密度，并按2×105個/孔細胞接種于6孔板中，使用不含抗生素及血清的培養基進行轉染試劑PEI的稀釋，室溫放置5 min；向混合液中加入1 μg GFP-LC3質粒DNA混勻，室溫放置15 min；將混合液加入細胞培養孔中，常規條件培養6 h并更換新鮮培養基；按方法1.2.3進行細胞處理及分組，培養48 h后，室溫條件下加入4%多聚甲醛固定細胞30 min；加入0.1 mg/L DAPI染液，室溫條件下染色2 min，PBS洗滌細胞一次后封片，最后于熒光顯微鏡下觀察細胞熒光。

1.2.8Western blot 取上述各組細胞，棄去培養基，PBS洗滌細胞，加入細胞裂解液，混勻并收集細胞至1.5 mL離心管中，BCA法測定蛋白濃度，100 ℃水浴加熱10 min，12 000 r/min離心10 min；配置相應濃度的濃縮膠，將蛋白樣品及Maker依次上樣后60 V電泳，待樣品進入分離膠后，調整為110 V繼續電泳至樣品達分離膠底部。使用甲醇激活過的聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜進行蛋白質轉膜。結束后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h；分別使用稀釋好的AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、LC3B(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000)一抗孵育至PVDF膜上，置于濕盒中4 ℃孵育過夜，回收一抗并使用TBST洗膜3次，每次10 min；使用偶聯辣根過氧化物酶二抗室溫條件下孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；按照ECL試劑盒說明書進行蛋白質顯色，置于化學發光檢測儀中檢測蛋白質條帶進行，使用Image J軟件進行圖像分析。

1.3統計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料多組間差異比較采用F檢驗，組間差異多重比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1MPP+對SH-SY5Y細胞損傷的作用 CCK-8法檢測MPP+處理后SH-SY5Y細胞活性，結果顯示隨著MPP+作用濃度的增加，SH-SY5Y細胞活力呈現逐漸降低的趨勢，其中1.0 mmol/L、2.5 mmol/L及5.0 mmol/L濃度MPP+作用后SH-SY5Y細胞活力相較于0 mmol/L顯著降低(P<0.01)，鑒于2.5 mmol/L及5.0 mmol/L濃度的MPP+作用后SH-SY5Y細胞活力下降至50%以下，因此本研究選擇1.0 mmol/L作為MPP+的給藥濃度。隨后再次應用CCK-8進一步明確MPP+的最佳作用時間，結果顯示隨MPP+作用時間的延長，SH-SY5Y細胞活力也呈現逐漸降低的趨勢，其中1 mmol/L的MPP+作用細胞12 h、24 h及48 h后SH-SY5Y細胞活力相較于0 h顯著降低(P<0.01)，鑒于1.0 mmol/L濃度的MPP+作用48 h后SH-SY5Y細胞活力也下降至50%以下。因此本研究應用1 mmol/L的MPP+處理細胞24 h作為最佳條件進行構建急性PD細胞模型，見表1～2。

表1 不同濃度MPP+處理后SH-SY5Y細胞活性變化 Table 1 Changes in SH-SY5Y cell viability after treatment with different concentrations of MPP+

表2 1.0 mmol/L MPP+處理不同時間下SH-SY5Y細胞活性變化Table 2 Changes of SH-SY5Y cell viability at different time of 1.0 mmol/L MPP+ treatment

2.2GP抑制MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡的作用 流式細胞檢測SH-SY5Y細胞凋亡的結果顯示，相較于Control組，MPP+組及MPP++GP組的SH-SY5Y細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)，GP組SH-SY5Y細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)；相較于MPP+組，MPP++GP組SH-SY5Y細胞凋亡率均顯著減少(P<0.01)。 見圖1，表3。

圖1 京尼平苷對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的流式細胞圖A.對照組；B.MPP+組；C.GP組；D.MPP++GP組Figure 1 Flow cytometry of geniposide on the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by MPP+

表3 京尼平苷對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡率的影響Table 3 Effect of geniposide on the apoptosis rate of SH-SY5Y cells induced by MPP+

2.3京尼平苷減輕MPP+誘導SH-SY5Y細胞氧化應激的作用 相較于Control組，MPP+組LDH活性及MDA含量顯著增加(P<0.01)，且SOD活性顯著降低(P<0.01)，而GP組及MPP++GP組的LDH、SOD活性及MDA含量均差異無統計學意義(P>0.05)；相較于MPP+組， MPP++GP組LDH活性及MDA含量顯著降低(P<0.01)，SOD活性顯著增加(P<0.01)，見表4。

表4 京尼平苷對MPP+誘導SH-SY5Y細胞分泌LDH、SOD活性及MDA含量的影響Table 4 Effect of geniposide on the secretion of LDH,SOD and MDA content in SH-SY5Y cells induced by MPP+

2.4京尼平苷對MPP+誘導SH-SY5Y細胞自噬的作用 熒光染色結果顯示，與Control組細胞相比，MPP+組細胞內綠色熒光聚集點明顯增加，GP組及MPP++GP組無明顯變化。與MPP組比較，MPP++GP組細胞綠色熒光聚集現象明顯降低(圖2)。

圖2 外源性表達GFP-LC3后觀察GP對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞自噬的影響(綠色熒光為GFP-LC3染色，藍色熒光為DAPI染色，×400，標尺為10 μm)Figure 2 Effectof GP on MPP+ induced autophagy in SH-SY5Y cells after exogenous expression of GFP-LC3 (Green fluorescence is GFP-LC3 staining, blue fluorescence is DAPI staining, ×400, scar bar=10 μm)

2.5GP對MPP+誘導SH-SY5Y細胞自噬相關蛋白表達的作用 相較于Control組，MPP+組細胞中自噬標記分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及AMPK/mTOR信號通路中AMPK蛋白磷酸化水平均顯著增高(P<0.01)，而mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.01)，GP組及MPP++GP組的細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、AMPK及mTOR磷酸化水平間差異無統計學意義(P>0.05)；相較于MPP+組，GP組及MPP++GP組自噬標記分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及AMPK/mTOR信號通路中AMPK蛋白磷酸化水平均顯著降低(P<0.01)，而mTOR蛋白磷酸化水平顯著增高(P<0.01)。Western blot結果見圖3，表5。

圖3 GP對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞自噬相關蛋白表達的Western blot圖Figure 3 Western blot of MPP+ induced autophagy-related protein expression in SH-SY5Y cells induced by GP

表5 GP對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞自噬相關蛋白表達的影響Table 5 Effect of MPP+ induced autophagy-related protein expression in SH-SY5Y cells induced by GP

2.6GP通過AMPK/mTOR通路調控MPP+誘導的SH-SY5Y細胞自噬 Western blot結果顯示，在添加AMPK激動劑Met或mTOR抑制劑Rap后，與MPP+組比較，MPP++Met組或MPP++Rap組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與p-MAPK磷酸化水平明顯增加(P<0.01)，mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.01)；而與MPP++GP組比較，MPP++GP+Met組或MPP++GP+Rap組細胞中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與p-MAPK磷酸化水平明顯增加(P<0.01)，mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.01)。Western blot結果見圖4，表6。

圖4 添加Met或Rap后GP對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞自噬相關蛋白表達的Western blot圖A.添加Met后檢測結果；B.添加Rap后檢測結果Figure 4 Western blot of autophagy-related protein expression in SH-SY5Y cells induced by MPP+ after GP treatment after adding Met or Rap

表6 添加Met或Rap后GP對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞自噬相關蛋白表達的影響Table 6 Effect of autophagy-related protein expression in SH-SY5Y cells induced by MPP+ after GP treatment after adding Met or Rap

3 討 論

PD的發病機制十分復雜，臨床用于治療PD的藥物主要包含左旋多巴、抗膽堿藥及多巴胺受體激動劑等。由于上述藥物應用于臨床會引起嚴重的不良反應，例如低血壓、惡心嘔吐及不自主運動等[9]，因此探究新型治療藥物對PD的神經保護作用十分重要。MPP+能夠引起神經細胞的氧化應激損傷以及細胞凋亡的神經毒性，因此常作為帕金森細胞模型的誘導劑[10]。所以本研究首先利用MPP+誘導SH-SY5Y細胞構建了PD細胞模型，結果顯示誘導后的細胞活力明顯下降，且細胞凋亡率明顯增高，氧化應激損傷嚴重，表明成功制備了PD細胞模型，為后續的實驗奠定了基礎。PD的發病與細胞自噬密切相關，而細胞內的大分子蛋白及受損細胞器均由大自噬降解，通過調控細胞中的自噬活性來找尋PD的治療潛在靶點，將是未來的研究熱點。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其參與細胞增殖、凋亡及自噬等多種生物學過程。且mTOR蛋白的磷酸化水平變化能夠調控下游的自噬信號激活途徑。當mTOR蛋白的磷酸化水平增加時，mTOR信號通路被激活，則細胞自噬受到抑制[11-12]。AMPK是mTOR的上游信號通路，且AMPK能夠抑制mTOR，進而間接激活細胞自噬。AMPK主要通過兩種途徑參與細胞自噬的調控，一是AMPK可以直接磷酸化mTOR的抑制蛋白，促進自噬；二是直接磷酸化Raptor，進而激活自噬[13]。Arsikin等[14]研究發現藥物能夠通過AMPK抑制mTOR，進而誘導細胞發生自噬，最終造成PD細胞模型的細胞毒性作用。而本研究發現MPP+藥物誘導SH-SY5Y細胞后，發生了AMPK磷酸化水平的增加并伴隨著mTOR磷酸化水平的抑制，這提示MPP+介導的SH-SY5Y細胞自噬中存在AMPK/mTOR信號通路的參與。

GP是一類環烯醚萜葡萄糖苷，是梔子的主要藥效成分。有研究表明GP對心血管疾病及中樞神經疾病治療效果顯著之外，還具有一定的抗炎及抗軟組織損傷的作用[15-16]。同時，近年來有研究證實，GP對帕金森動物模型具有神經保護作用[17]。為了進一步確認GP對PD細胞模型氧化應激及凋亡的調控作用，本研究使用GP處理MPP+誘導SH-SY5Y細胞的PD細胞模型，結果表明使用GP藥物處理后的PD細胞模型凋亡率明顯降低。探究細胞氧化應激的作用時，本研究檢測了處理后細胞中MDA含量、SOD及LDH活性的變化。LDH活性能夠反映出細胞膜發生損傷的嚴重程度；MDA含量能夠間接反映出機體受到自由基攻擊的程度；而SOD活性能夠間接反映出機體清除自由基的能力；上述三種指標常用于評估細胞的氧化應激反應[18-20]。本研究發現添加GP處理后，MPP+誘導的SH-SY5Y細胞上清液中LDH活性及MDA含量明顯降低，SOD活性明顯升高。同時GP能夠抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞的AMPK磷酸化，激活mTOR的磷酸化，且顯著的修復了這些細胞自噬調控蛋白的磷酸化水平。表明GP能夠降低MPP+誘導的SH-SY5Y細胞的氧化應激損傷，并且能夠通過阻斷自噬調節中的AMPK/mTOR信號通路，發揮抑制細胞自噬的作用。

本研究為了進一步確認GP抑制細胞自噬依賴于AMPK/mTOR信號通路，分別利用AMPK激動劑Metformin及mTOR抑制劑Rapamycin進行MPP+誘導的SH-SY5Y細胞的處理。結果顯示，GP處理后細胞的自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達水平降低，AMPK磷酸化水平降低，而mTOR磷酸化水平上升。而Metformin或Rapamycin能夠明顯加劇MPP+誘導的SH-SY5Y細胞的自噬水平，表現出LC3-II表達水平上升，AMPK磷酸化水平上升，而mTOR磷酸化水平降低。表明GP能夠通過AMPK/mTOR信號通路調控PD細胞自噬，且AMPK激動劑Metformin及mTOR抑制劑Rapamycin在一定程度上能夠激活PD細胞自噬。但是有研究證明自噬在PD中能夠起到保護神經元細胞的作用[21-23]。自噬是一把雙刃劍，自噬的啟動能夠有助于神經元穩態的維持，繼而減少繼發性損傷；但自噬的過度激活會導致神經元細胞的死亡，進而加速神經元變性的進程。因此后續還需要繼續探究GP對PD自噬水平的調控作用，同時探究AMPK激動劑Metformin及mTOR抑制劑Rapamycin對帕金森細胞凋亡的影響機制。

綜上所述，GP能夠通過AMPK/mTOR信號通路調控MPP+誘導SH-SY5Y細胞的凋亡、自噬及氧化應激過程。本研究結果能夠為找尋安全且高效治療PD疾病的藥物提供理論及實驗依據。