NSCLC組織中8-OHdG、p53的表達與患者臨床病理特征及預后的關系

贠宇輝，景 鑫，楊恩德

空軍軍醫大學唐都醫院/空軍軍醫大學第二附屬醫院胸腔外科，陜西西安 710038

肺癌是當今最常見的癌癥，病死率極高，而吸煙是肺癌發病的主要原因，但其影響肺癌發生、發展的機制目前尚未明確[1]。有研究報道吸煙是氧化應激的主要誘因，而氧化應激可以導致DNA損傷和腫瘤相關基因突變[2]，因此吸煙可能通過引起氧化應激反應而導致腫瘤發生、發展。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是公認的氧化應激標志物，由于其只能通過DNA氧化損傷途徑形成，且可以在體內穩定存在而不受飲食等因素影響，很容易被檢測到，因此被用于評估氧化應激的產生[3]。曾有研究報道8-OHdG在癌癥中的表達增加與預后不良有關[4]。但也有研究表明，在乳腺癌患者血清和癌組織中8-OHdG的低表達反而與乳腺癌的浸潤性相關，而且8-OHdG低表達的患者生存率會更低[5]。因此8-OHdG表達作為一種生物標志物的臨床意義仍存在爭議，且目前關于非小細胞肺癌(NSCLC)組織中8-OHdG表達的研究尚少。

人抑癌基因p53是調控細胞活性、DNA修復和凋亡的重要轉錄因子。p53突變是在肺癌中發現的最常見的突變之一，且在吸煙導致的肺癌中更為常見[6]。在煙草的煙霧顆粒中存在60多種致癌物可以導致基因突變，p53的突變導致DNA的修復能力受損，從而促使癌癥加劇[7]。有研究發現惡性黑色素瘤p53陽性表達患者中，8-OHdG的陽性免疫反應較多[8]。因此，本研究應用免疫組織化學方法檢測8-OHdG、p53在NSCLC組織中的表達水平，并分析二者與吸煙等臨床病理特征和患者預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2007年1月至2015年12月在本院接受手術治療的203例NSCLC患者作為研究對象，收集患者的完整住院病歷資料及手術切除的組織標本。組織標本經10%中性甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，標本用H&E染色后，至少由2名病理醫師完成組織學診斷，術后均經病理證實為NSCLC。203例患者中男147例(72.4%)，女56例(27.6%)，中位年齡65歲；吸煙79例，不吸煙124例。按照世界衛生組織2015年肺腫瘤組織學分類，鱗癌94例，腺癌109例；按國際肺癌研究協會第8版TNM分期標準進行T分期和N分期，T1+T2期119例、T3+T4期84例，N0期108例、N1期95例。

1.2主要試劑 8-OHdG抗體購自美國密理博公司，Ki-67抗體(DAKO)、鼠抗人單克隆抗體p53、免疫組織化學超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒、DAB試劑盒(20×)均購自福建邁新生物技術開發有限公司。

1.3免疫組織化學染色與評分 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法，進行8-OHdG、p53和Ki-67染色。組織切片脫蠟水化后，用檸檬酸鹽(pH值6.0)的抗原提取液在蒸煮器中煮沸20 min進行抗原修復。用8-OHdG抗體(1∶200)、p53抗體(1∶800)和Ki-67抗體(1∶100)進行免疫組織化學染色。DBA顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，最后脫水、透明、封片觀察?？瞻讓φ战M一抗用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替，具體操作步驟按照免疫組織化學超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒說明進行。

根據細胞核染色程度及陽性細胞率對免疫組織化學染色進行評價，8-OHdG和Ki-67的免疫組織化學染色在≥10%時為陽性。p53的免疫組織化學結果根據文獻[9]分為3類：陰性表達、低表達(1%～50%陽性染色核)、高表達(>50%陽性染色核)，根據該文獻將p53免疫組織化學染色結果p53高表達定義為異常表達，p53低表達定義為野生型表達。

1.4隨訪 通過電話、門診、住院等方式隨訪，在手術治療后的首2年內，每3個月進行1次隨訪，隨后每6個月隨訪1次。最后1次隨訪的日期記錄為截至2020年12月或患者死亡。

1.5統計學處理 采用SPSS22.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以頻數、率表示，組間比較采用χ2檢驗；繪制Kaplan-Meier生存曲線，采用Log-rank檢驗比較不同臨床病理特征NSCLC患者的總生存率；采用單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析影響NSCLC患者生存期的危險因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1NSCLC患者不同臨床病理特征與8-OHdG表達的關系 免疫組織化學染色結果顯示，83.3%(169/203)的NSCLC組織呈8-OHdG陽性表達，且8-OHdG僅在腫瘤細胞核中表達。8-OHdG陰性表達與男性、鱗癌、T分期高、N1期、吸煙有關(P<0.05)；吸煙患者8-OHdG的陽性表達率為73.4%，低于不吸煙患者的89.5%(P<0.05)，見表1。

表1 NSCLC患者不同臨床病理特征與8-OHdG表達水平的關系[n(%)]

續表1 NSCLC患者不同臨床病理特征與8-OHdG表達水平的關系[n(%)]

2.2NSCLC患者不同臨床病理特征與p53表達水平的關系 p53免疫組織化學結果顯示，p53野生型表達占29.6%(60/203)，p53異常表達占70.4%(143/203)。p53異常表達與男性、鱗癌、吸煙及Ki-67陽性表達有關(P<0.05)；吸煙患者p53野生型表達率為13.9%，低于不吸煙患者的39.5%(P<0.05)，吸煙患者的P53異常表達率為86.1%，高于不吸煙患者的60.5%(P<0.05)；8-OHdG陰性表達的患者中p53異常表達率為82.4%，高于8-OHdG陽性表達患者的68.0%，但差異無統計學意義(P>0.05)；p53野生型表達和p53異常表達在腫瘤分期上差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 NSCLC患者不同臨床病理特征與p53表達水平的關系[n(%)]

續表2 NSCLC患者不同臨床病理特征與p53表達水平的關系[n(%)]

2.3影響NSCLC患者生存期危險因素的單因素Cox比例風險回歸模型分析 采用單因素Cox比例風險回歸模型對NSCLC患者臨床病理特征進行分析，結果顯示，年齡≥65歲、男性、吸煙、T分期高、N1分期、8-OHdG陰性表達、p53異常表達及Ki-67陽性表達是影響NSCLC患者生存期的危險因素，見表3。

表3 NSCLC患者生存期危險因素的單因素Cox比例風險回歸模型分析

203例NSCLC患者隨訪至2020年12月，結果顯示，死亡84例，生存119例，繪制不同臨床病理特征NSCLC患者的Kaplan-Meier生存曲線，采用Log-Rank檢驗分析，結果顯示，8-OHdG陰性表達、p53異常表達、Ki-67陽性表達、吸煙及T分期高的患者總生存率更低(P<0.05)，見圖1。

2.4影響NSCLC患者生存期危險因素的多因素Cox比例風險回歸模型分析 采用多因素Cox比例風險回歸模型對單因素分析中有統計學意義的危險因素進行分析，結果顯示，年齡≥65歲、吸煙和T分期高是影響NSCLC患者生存期的獨立危險因素(HR=2.154、2.371、2.346，P<0.05)，而8-OHdG陰性表達和p53異常表達并不是影響NSCLC患者生存期的獨立危險因素(HR=1.486、1.211，P>0.05)，見表4。

表4 NSCLC患者生存期危險因素的多因素Cox比例風險回歸模型分析

注：A、B、C、D、E表示不同8-OHdG、p53、Ki-67表達及吸煙與否、T分期高低的生存曲線。

3 討 論

本研究通過免疫組織化學分析觀察8-OHdG和p53在NSCLC組織中的表達情況，結果表明，83.3%的NSCLC患者組織中存在8-OHdG陽性表達，其中8-OHdG的陰性表達與男性、鱗癌、T分期高、N1期、吸煙有關(P<0.05)，p53異常表達與吸煙、男性、鱗癌及Ki-67陽性表達有關(P<0.05)，但8-OHdG陰性表達和p53異常表達不是NSCLC患者生存期的獨立危險因素(P>0.05)。

有研究表明吸煙是引起氧化應激的重要原因，而氧化應激會導致嚴重的DNA損傷，這是NSCLC的重要致癌機制[2,10]。體內大量活性氧(ROS)的產生是氧化應激發生的主要原因，ROS的壽命較短，可以通過細胞防御機制快速降解和去除，所以直接測定ROS來評估氧化應激水平十分困難[10]。8-OHdG是ROS引起DNA損傷后產生的代謝終產物，在細胞內可以維持55 min不被清除，所以8-OHdG是目前公認的氧化應激生物標志物[3]。8-OHdG表達的增加與人體衰老及一些病理過程有關，包括癌癥、糖尿病和高血壓等，現已發現其在肺癌、肝癌、前列腺癌和胃癌等多種癌癥中均有表達[3-4]。然而，對于8-OHdG作為癌癥反應的生物標志物仍然存在爭議，因為有研究表明8-OHdG的陰性表達與乳腺癌的侵襲性表型有關，且與更差的預后有關[11]。這與本研究發現的8-OHdG陰性表達與NSCLC患者較差的臨床病理特征和生存期密切相關一致。目前對出現這種相反結果的原因進行探討的研究尚少，SOVA等[12]認為腫瘤組織中ROS的過量產生會引起抗氧化酶的過量表達，從而刺激腫瘤細胞的抗氧化防御能力增強而避免由ROS引起的腫瘤細胞的凋亡和壞死，使腫瘤得以繼續發展。同時抗氧化酶阻止ROS對DNA的損傷作用而導致8-OHdG水平下降[13]。因此，這也可能是本研究中8-OHdG陰性表達的NSCLC患者預后較差的原因之一。因此，對8-OHdG在癌癥發生、發展中相關機制的研究還需要繼續進行，這對可能把8-OHdG作為NSCLC治療的生物標志物有重大意義。

本研究還發現，8-OHdG的陰性表達與患者吸煙相關(P<0.05)，然而目前可以解釋吸煙與8-OHdG陰性表達間關系的機制尚不明確。但是，根據SOVA等[12]的研究理論可以得出吸煙引起8-OHdG表達水平下降可能是氧化應激在整個過程中發揮了重要作用的結果。因為煙草中含有的致癌物會誘導自由基和ROS的形成從而引起氧化應激反應，而氧化應激反應的一系列機制引起8-OHdG表達水平下降[14]。這可能是解釋吸煙與8-OHdG陰性表達間關系的機制之一，但是其中是否還存在其他相關機制還有待進一步研究。

p53突變是肺癌與吸煙有關的一種重要突變，其導致野生型p53功能喪失和突變p53功能增強，是NSCLC產生的重要原因[6]。有研究報道p53的免疫組織化學染色可以作為p53突變分析的代替品，因為野生型p53的半衰期很短，蛋白非常不穩定而難以被測定，而突變的p53在細胞中的表達蛋白可以比較穩定地存在，所以如果在組織或細胞中檢測到p53的過表達，則可以判定p53發生了突變[15]。在本研究中，將p53免疫組織化學染色結果分為野生型表達和異常表達，并且分析了p53表達與NSCLC患者的臨床病理特征的相關性。有研究對腺癌和鱗癌中p53的表達進行分析，發現p53在鱗癌和腺癌中的異常表達率分別為81%和46%[7]，與本研究中鱗癌的p53異常表達率高于腺癌一致。另外，p53異常表達與吸煙、男性、鱗癌和Ki-67陽性表達密切相關(P<0.05)。

綜上所述，本研究證實了8-OHdG陰性表達和p53異常表達與吸煙和較差的預后有關，但二者不是影響NSCLC患者生存期的獨立危險因素，其為NSCLC患者的治療及預后判斷提供了重要的依據。