參靈頤肝湯對對乙酰氨基酚所致肝損傷小鼠的治療及作用機制研究※

邱 銳 史艷平 趙珍珍

(陜西中醫藥大學2019級碩士研究生，陜西 咸陽 712046)

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是由化學藥、生物制劑、傳統中草藥等引起的肝臟損害，是世界各國藥物開發和臨床應用中導致急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)的主要問題[1-2]。對乙酰氨基酚(APAP)是導致DILI的常見原因之一。雖然APAP在治療劑量下是安全的，但是過度使用會導致嚴重的肝臟損傷，甚至ALF[3-4]。根據DILI臨床表現及特點可將其歸屬于中醫學“虛勞”“黃疸”“鼓脹”等范疇[5]。陜西省西安市兒童醫院中西醫結合科史艷平主任醫師基于多年臨床經驗及“相火”理論，所擬經驗方參靈頤肝湯在DILI治療中取得較好療效，但具體作用機制尚不清楚。本研究旨在探究參靈頤肝湯對APAP所致肝損傷小鼠的治療效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級ICR小鼠50只，體質量(15±4)g，4周齡，雌雄各半，購于成都達碩實驗動物有限公司[動物生產許可證號：SCXK(川)2020-030]，飼養于陜西中醫藥大學動物實驗室，試養7 d，觀察小鼠處于正常狀態，飼養期間各小鼠自由飲水，飼料購于成都達碩實驗動物有限公司，實驗室溫度控制在24 ℃左右，濕度控制在50%～70%。

1.2 藥品及試劑 參靈頤肝湯藥物組成：北沙參8 g，麥冬8 g，白芍10 g，靈芝8 g，五味子10 g，紫草10 g，茜草10 g，生地黃8 g，百合8 g，佛手8 g，甘草8 g，購自陜西中醫藥大學校醫院。取藥材加10倍水浸泡后煎煮3次，取出藥液合并過濾，濃縮至3.5 g/mL。對乙酰氨基酚(北京索萊寶科技有限公司，批號A9421)以蒸餾水稀釋配置成濃度為25 mg/mL的溶液；乙酰半胱氨酸(北京索萊寶科技有限公司，批號C8460)以蒸餾水稀釋配置成濃度為10 mg/mL溶液。試劑盒：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(批號C009-2)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(批號C010-2)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號A003-1)、總膽紅素(TBiL)試劑盒(批號C019-1)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號A001-1)，均購自南京建成生物工程研究所；白細胞介素6(IL-6)試劑盒(批號EK206/3-01)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒(批號88-7324)，均購自杭州聯科生物技術股份有限公司。

1.3 儀器 5417 R高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；ELXSOSIU全自動酶標儀(美國Bio-Tek公司)；R136石蠟切片機(湖北泰維科技實業股份有限公司)；TC-120S+生物組織自動脫水機(湖北泰維科技實業股份有限公司)；TB-718EL冷凍臺、包埋機(湖北泰維科技實業股份有限公司)；TK-218Ⅱ生物組織攤片、烤片機(湖北泰維科技實業股份有限公司)；電子精密天平(德國賽多利斯公司)；CL-300W制冰機(上海岑隆電器設備有限公司)；超低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)；GL150干式恒溫箱(上海雙旭電子有限公司)；XHF-D高速勻漿器(鄭州南北儀器設備有限公司)；微量移液器(北京普利智誠生物技術有限公司)；光學顯微鏡及顯微照相系統(日本Olympus公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 試養7 d后，將50只小鼠按照隨機數字表法分為空白對照組、模型組、乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組、兩藥聯用組，每組10只，雌雄各半。

1.4.2 造模及給藥 造模：空白對照組予0.9%氯化鈉注射液0.13 mL/10 g灌胃；其余4組予APAP溶液0.13 mL/10 g灌胃。每2 d 1次，連續2周，建立急性肝損傷模型。前期實驗研究顯示，以APAP溶液0.13 mL/10 g連續灌胃2周，小鼠血清中AST、ALT水平顯著升高，光學顯微鏡下觀察到小鼠肝細胞結構遭到破壞，炎癥細胞呈彌漫性浸潤，提示小鼠急性肝損傷模型制作成功。灌胃給藥：造模成功后，空白對照組、模型組予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL/10 g灌胃；乙酰半胱氨酸組予乙酰半胱氨酸溶液0.1 mL/10 g腹腔注射；參靈頤肝湯組予參靈頤肝湯0.2 mL/10 g灌胃；兩藥聯用組予參靈頤肝湯0.2 mL/10 g灌胃聯合乙酰半胱氨酸溶液0.1 mL/10 g腹腔注射。每日1次，連續2周。

1.5 觀察指標 ①小鼠末次灌胃給藥后禁食不禁水，24 h后稱體質量并取材。全部小鼠用4%水合氯醛0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，采用摘眼球取血法取血0.4～0.5 mL，將血液在室溫下穩定15 min，3000 r/min離心10 min，取血清，采用微板法檢測AST、ALT含量，采用釩酸氧化法檢測TBiL含量，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。②采用脫臼法處死小鼠，立即解剖取出肝臟組織，取肝左葉0.2 g，利用高速勻漿器制成10%肝組織勻漿。將制備好的肝臟勻漿液以5000 r/min離心10 min,取上清液，采用酶聯免疫吸附法檢測IL-6、TNF-α含量，采用羥胺法檢測SOD含量，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。③于肝臟右葉上取大小約5 mm×5 mm×4 mm的組織，置于4%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色。制成切片后分別在100倍、400倍光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學變化。

2 結果

2.1 各組小鼠血清AST、ALT、TBiL水平比較 見表1。

表1 各組小鼠血清AST、ALT、TBiL水平比較

由表1可見，與空白對照組比較，模型組、乙酰半胱氨酸組小鼠血清AST、ALT、TBiL水平均升高(P<0.05)；參靈頤肝湯組小鼠血清AST、ALT水平均升高(P<0.05)，TBiL水平無明顯變化(P>0.05)；兩藥聯用組小鼠血清AST水平升高(P<0.05)，ALT、TBiL水平無明顯變化(P>0.05)。與模型組比較，乙酰半胱氨酸組、兩藥聯用組小鼠血清AST、ALT、TBiL水平均降低(P<0.05)；參靈頤肝湯組小鼠血清AST、TBiL水平均降低(P<0.05)，ALT水平無明顯變化(P>0.05)。與乙酰半胱氨酸組比較，參靈頤肝湯組、兩藥聯用組小鼠血清AST、TBiL水平均降低(P<0.05)，ALT水平無明顯變化(P>0.05)。與參靈頤肝湯組比較，兩藥聯用組小鼠血清ALT水平降低(P<0.05)，AST、TBiL水平無明顯變化(P>0.05)。

2.2 各組小鼠肝組織IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平比較 見表2。

表2 各組小鼠肝組織IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平比較

由表2可見，與空白對照組比較，模型組、乙酰半胱氨酸組小鼠肝組織IL-6、MDA水平均升高(P<0.05)，SOD水平均降低(P<0.05)，TNF-α水平無明顯變化(P>0.05)；參靈頤肝湯組、兩藥聯用組小鼠肝組織SOD水平均降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α、MDA水平均無明顯變化(P>0.05)。與模型組比較，乙酰半胱氨酸組小鼠肝組織IL-6、TNF-α、MDA水平均降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)；參靈頤肝湯組、兩藥聯用組小鼠肝組織IL-6、MDA水平均降低(P<0.05)，TNF-α、SOD水平變化不明顯(P>0.05)。與乙酰半胱氨酸組比較，參靈頤肝湯組小鼠肝組織MDA水平降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α、SOD水平變化不明顯(P>0.05)；兩藥聯用組小鼠肝組織IL-6、MDA水平均降低(P<0.05)，TNF-α、SOD水平變化不明顯(P>0.05)。與參靈頤肝湯組比較，兩藥聯用組小鼠肝組織IL-6水平降低(P<0.05)，TNF-α、SOD、MDA水平變化不明顯(P>0.05)。

2.3 各組小鼠肝組織病理變化 空白對照組小鼠肝細胞核排列規整，可以清晰地看到肝小葉結構；模型組小鼠肝細胞的結構遭到破壞，肝細胞出現不同程度壞死、變性，肝索紊亂并伴有明顯的炎癥細胞浸潤；與模型組比較，乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組及兩藥聯用組肝組織結構均有不同程度的改善，乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組有少量炎性浸潤，細胞壞死的現象減輕，兩藥聯用組細胞排列比較整齊，未見大面積炎性浸潤及壞死，與空白對照組最為相似。見圖1、2。

圖1 各組小鼠肝組織病理學變化(HE，×100)

圖2 各組小鼠肝組織病理學變化(HE，×400)

3 討論

DILI大多數臨床癥狀不明顯，但也有少數表現為肝區不適、乏力、厭食、皮疹等，嚴重時可出現ALF，DILI已成為國際肝病和消化病學研究的熱點[6-7]。APAP是兒童使用最廣泛的非處方藥物之一，服用過量可導致嚴重肝毒性，這已成為全球公共健康問題[8-9]。APAP是由細胞色素p450s代謝生成活性代謝物N-乙酰-對苯醌亞胺(NAPQI)，主要通過細胞色素P450 2E1(CYP2E1)代謝。然而，APAP過度使用后，NAPQI對肝細胞內和線粒體內谷胱甘肽過多的消耗。剩余的NAPQI與細胞生物大分子，特別是蛋白質發生反應，形成共價鍵，導致線粒體受損，肝細胞死亡，甚至肝衰竭[4,10]。目前，DILI無特異性治療方法，主要是在停用可疑藥物基礎上給予對癥治療，可以采用的西藥主要分為利膽類、降酶類、解毒類、抗炎類保肝藥物，以乙酰半胱氨酸、甘草酸鎂、聯苯雙酯等為代表，可通過增強肝臟解毒作用，減少有害物質對肝臟損害，促進膽汁分泌，減輕膽汁淤積，抗炎，降低轉氨酶等起到保肝護肝作用[11]。乙酰半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的N-乙酰衍生物，是預防因服用過量APAP引起的肝毒性的首選藥物及唯一解毒藥物，被認為是谷胱甘肽的替代品和前體，并與NAPQI結合，同時補充耗盡的谷胱甘肽儲備，特別是在肝臟[12-13]。然而臨床應用往往難以取得滿意療效。

近年來中醫藥治療DILI已得到眾多醫家認可，有報道稱中藥治療DILI具有多靶點、改善肝臟微循環、強抗氧化、無創等優點[5]。然而對于中藥系統機制研究較為缺乏，不能為指導臨床用藥提供依據。以益氣養陰，兼柔肝利膽、涼血解毒為治則擬方的參靈頤肝湯在臨床上取得較好療效，但具體作用機制尚不清楚。故研究以參靈頤肝湯對DILI小鼠模型治療前后小鼠一般情況及相關指標水平的變化，探討參靈頤肝湯治療DILI的作用機制。參靈頤肝湯君以北沙參、靈芝益氣養陰，補益肝氣；北沙參不僅防木旺侮金，亦能養肺陰。臣以麥冬、五味子、白芍助君藥養陰柔肝保肝；茜草、紫草涼血解毒。佐以百合、生地黃，百合助臣藥養肝體，潤肺防“木旺侮金”；生地黃養陰清熱。佛手、甘草為使藥，佛手疏肝氣，引藥入肝經，還可防止大量養陰藥阻礙肝氣條達；甘草清熱解毒，調和諸藥。諸藥配伍，既能補肝體之陰，又可柔斂肝氣，兼能疏肝利膽，理氣解毒，清熱涼血。現代藥理研究發現，北沙參可以降低大鼠血清AST、ALT、MDA含量,提高肝臟勻漿液中SOD含量，而且北沙參可以抑制大鼠肝細胞中的一氧化氮(NO)產生[14-15]；靈芝具有降低肝臟血脂水平，保肝護肝的作用[16]；五味子多糖、紫草對DILI肝組織具有保護作用[17-18]。

DILI通常沒有具體的臨床表現，許多患者可能只表現為肝臟生化指標水平升高。臨床上檢測DILI的傳統血清生物標志物有ALT、AST和TBiL[6]。肝細胞膜受損時,細胞內的AST、ALT就會釋放入血,導致血清AST、ALT水平升高。有研究發現，APAP毒性引起的肝功能障礙最初是通過檢測AST和ALT濃度來確定的[19]。TBiL是肝臟生化指標，當肝臟受損害后，其水平會明顯增加[20]。本實驗研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清AST、ALT、TBiL水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，乙酰半胱氨酸組、兩藥聯用組ALT均降低(P<0.05)，乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組、兩藥聯用組小鼠血清AST、TBiL水平均降低(P<0.05)。表明參靈頤肝湯、乙酰半胱氨酸在一定程度上改善了APAP致DILI小鼠的肝損傷程度。兩藥聯用組比參靈頤肝湯組、乙酰半胱氨酸組AST、ALT及TBiL水平降低更加明顯，說明兩藥聯用組改善DILI小鼠肝損傷程度更加有效。

IL-6是與炎癥性疾病相關的細胞因子的核心成員，又被稱為肝細胞刺激因子，在肝臟再生的過程中發揮著重要作用。研究表明，IL-6不僅是肝臟炎癥的重要指標,也是判斷肝臟炎癥和預后的重要實驗指標[21]。TNF-α為促進炎性反應的重要因子，已被認為是DILI發病的核心介質，當TNF-α的表達過度時，體內免疫細胞遭受刺激，合成更多炎癥因子，包括IL-1β、IL-6等，共同刺激炎癥發生及發展，導致炎癥細胞的浸潤，發生急性的肝臟炎性損害[22-23]。本實驗研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組肝組織IL-6水平升高(P<0.05)，經過乙酰半胱氨酸、參靈頤肝湯、乙酰半胱氨酸聯合參靈頤肝湯治療后，小鼠肝組織IL-6水平均降低(P<0.05)，說明參靈頤肝湯及乙酰半胱氨酸可以在一定程度上抑制炎癥因子IL-6的產生，保護APAP所致的肝損傷，且與乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組比較，兩藥聯用組肝組織IL-6降低(P<0.05)，表明乙酰半胱氨酸與參靈頤肝湯聯合用藥效果更好。

SOD是一種廣泛存在于生物體中的金屬酶，具有很強的抗氧化功能，它能催化自由基歧化，去除脂質過氧化物和氧自由基，保護肝細胞免受損害，保持氧化與抗氧化反應的穩定性。相關研究發現，肝臟的抗氧化活性可以直接反映肝臟的抗氧化能力[24]。MDA是脂質過氧化物的降解產物，可破壞細胞膜結構。MDA含量可反映脂質過氧化程度，間接反映細胞損傷程度。SOD活性可間接反映氧自由基的清除能力，MDA含量可間接反映自由基誘導的損傷程度[25]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠肝組織中SOD活性均下降、MDA水平均升高(P<0.05)，說明小鼠的抗氧化能力遭受嚴重破壞，肝組織發生了氧化損傷；與模型組比較，乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組、兩藥聯用組小鼠肝組織MDA水平均降低(P<0.05)。表明乙酰半胱氨酸及參靈頤肝湯可以通過增強肝細胞的抗氧化能力減輕肝損傷程度。

綜上，在APAP致DILI模型小鼠中，參靈頤肝湯可以減輕肝臟炎癥，改善肝臟損傷的程度，其作用機制可能與抑制細胞凋亡和抗炎、抗氧化有關。因此，參靈頤肝湯可以作為臨床治療兒童DILI藥物。但本實驗樣本量偏少，為進一步了解參靈頤肝湯對APAP致DILI小鼠的治療效果及作用機制，仍需進行深入研究。