益生元對益生菌的增殖效應實驗在本科教學中的應用

劉麗艷，馮 坤，婁文勇，蘇健裕，吳 虹

(華南理工大學食品科學與工程學院，輕工與食品國家級實驗教學示范中心，廣東 廣州510640)

0 引言

食品微生物學是食品科學與工程專業的主干課程，食品微生物學實驗是實踐教學中的重要環節。現有實驗教學通過對學生基礎實驗技能的培養，較好地完成了理論課知識的驗證，但由于實驗內容簡單且欠缺關聯性等因素，使得課程結束后學生理論聯系實際尚不足，對科學研究的認知度仍欠缺。目前，基于“新工科”建設背景下，食品微生物實驗課的教學改革仍處于起步階段，為了提高食品微生物課程的教學水平，以工程素質人才培養為導向，結合學科發展前沿技術及與生活緊密相關的科學問題，對微生物實驗課進行教學內容和實踐模式的雙重優化，開展綜合型探索性實驗具有重要意義[1-2]。

隨著人類腸道菌群的發現及其對健康重要作用的逐步明確，益生菌成為微生物領域關注的熱點[3]。益生菌是指對人體健康有益且與人共生的細菌或微生物。益生元是益生菌的食物，是指一些不被宿主消化吸收卻能夠選擇性地促進體內有益菌的代謝和增殖，從而改善宿主健康的有機物質[4]。目前，常用的益生元有低聚糖類，包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖和菊粉等。此外，多糖如云芝多糖、胡蘿含氮多糖，以及有些微藻類和天然植物中的蔬菜、中草藥等也能作為益生元使用[5]。益生元在促進結腸菌群的生長，改善腸道微生態，促進脂質、蛋白質與礦物類代謝方面具有重要意義，愈來愈廣泛地被應用于食品、飼料等領域中。

本實驗以低聚果糖(FOS)、低聚異麥芽糖(IMO)作為培養基碳源，以無糖培養基和普通MRS培養基為陰性和陽性對照，考察低聚糖益生元對干酪乳桿菌(L.casei)增殖作用的影響。從實驗教學案例建設、實驗項目的組織及實施過程、實驗結果交流展示等方面總結了探索性實驗項目“益生元對益生菌的增殖效應實驗”在本科實驗教學中的實施過程，為食品微生物學實驗教學體系更新提供教學案例，供同類課程交流、探討。

1 益生元對干酪乳桿菌的體外生長調節作用實驗

1.1實驗目的

掌握滅菌、梯度稀釋、微生物的接種、培養及菌落計數等操作。完成兩種低聚糖對干酪乳桿菌的增殖效應檢測，了解益生元對益生菌體外增殖效應評價的方法。

1.2材料及儀器

(1)菌種。干酪乳桿菌ATCC393。

(2)無糖MRS基礎培養基的制備。蛋白胨，廣東環凱微生物科技有限公司，10.0 g；酵母提取物，南京全隆生物技術有限公司，5.0 g；乙酸鈉，西隴科學股份有限公司，5.0 g；二水合檸檬酸三銨，阿拉丁試劑(上海)有限公司，2.0 g；三水合磷酸氫二鉀，廣州化學試劑廠，2.0 g；七水合硫酸鎂，阿拉丁試劑(上海)有限公司，0.2 g；四水合硫酸錳，合肥巴斯夫生物科技有限公司，0.05 g；吐溫-80，天津市科密歐化學試劑有限公司，1 mL[6]。pH值調為6.2，滅菌條件為115 ℃，20 min。

(3)其他試劑。低聚果糖(FOS，純度>99%)、低聚異麥芽糖(IMO，純度>99%)購自上海伯奧生物科技有限公司。

(4)儀器及器皿。滅菌鍋、厭氧培養箱、天平、移液槍及槍頭、接種環、pH計、紫外分光光度計、超凈工作臺、具塞錐形瓶、培養皿和具塞試管等。

1.3實驗步驟及內容設計

1.3.1菌株活化

取一定量受試干酪乳桿菌冷凍甘油管接種于MRS培養基中，37 ℃恒溫培養24 h，涂片并革蘭氏染色，經顯微鏡檢符合干酪乳桿菌顯微形態學特征后，即可以進一步實驗。

1.3.2實驗分組

(1)實驗條件1：不同益生元對干酪乳桿菌的增殖效應。

無糖MRS培養基中分別添加2%(w/v)葡萄糖、2%(w/v)FOS、2%(w/v)IMO，以無糖MRS培養基為對照。將活化后的菌液以1%(v/v)比例接種到對應的試管中，并于接種后2、4、6、8、10、12和16 h定時取樣，于600 nm波長條件下測定培養物的OD值，同時測定發酵液pH值，比較益生菌在不同培養基中的生長情況。

(2)實驗條件2：不同濃度FOS對干酪乳桿菌的增值效應。

無糖MRS培養基中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%(w/v)FOS，以無糖MRS培養基為對照。將活化后的菌液以1%(v/v)比例接種到對應的試管中，并于接種12 h后取樣，于600 nm波長條件下測定培養物的OD值，同時測定發酵液pH值，比較干酪乳桿菌在不同濃度FOS中的生長情況。

以上數據均重復測定3次，取平均值。

1.3.3生長指數的計算

通過生長指數法來測定細胞生長情況，以Growth Index(GI)值為指標，比較益生菌在不同低聚糖和葡萄糖上的生長情況[7]。

式中AP16——含有樣品益生元的干酪乳桿菌發酵液在培養16 h后于600 nm波長條件下的吸光度

AG16——含有樣品葡萄糖的干酪乳桿菌發酵液在培養16 h后于600 nm波長條件下的吸光度

AC16——含有無糖MRS培養基的干酪乳桿菌發酵液在培養16 h后于600 nm波長條件下的吸光度

AP0——含有樣品益生元的干酪乳桿菌發酵液0 h的吸光度讀數

AG0——含有樣品葡萄糖的干酪乳桿菌發酵液0 h的吸光度讀數

AC0——含有無糖MRS培養基的干酪乳桿菌發酵液0 h的吸光度讀數

1.4實驗結果與討論

1.4.1不同益生元對益生菌的增殖效應

分別以2%FOS、2%IMO作為碳源，在無糖培養基為基礎培養條件下，相較于2%葡萄糖作為碳源的培養基，生長曲線直接體現出不同益生元對益生菌的增殖效應。隨著干酪乳桿菌的增殖，其代謝產生的有機酸使得培養基pH值降低，因此，培養液的pH值可以反映出不同碳源對益生菌的增殖效果[8-9]。干酪乳桿菌以葡萄糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖為碳源的培養基及基礎對照培養基中的生長曲線和pH值變化曲線如圖1所示。

圖1 干酪乳桿菌的生長曲線和pH值曲線Fig.1 Growth curves and pH curves of L.casei

由于益生菌增殖過程中短鏈脂肪酸的產生，培養液OD600增加的同時pH值降低，反映了益生菌在各培養液中生長的能力。由圖1可知，培養2～10 h，干酪乳桿菌在Glc、FOS、IMO為碳源的培養液中的生長曲線呈現顯著增長，pH值曲線同步下降。10 h之后進入生長穩定期，隨后生長曲線及pH值曲線均趨于平穩。而無糖基礎培養基中，干酪乳桿菌培養液的OD600水平較低，pH值變化不顯著。干酪乳桿菌在以FOS、IMO為碳源發酵時表現出相似的生長活性，說明兩種低聚糖對干酪乳桿菌均有益生效果。發酵16 h后，各發酵液的OD600均達到了最高水平，以FOS為碳源的培養液的OD600值為2.63，略低于Glc組的2.80，高于IMO組的2.31。此時，生長在以FOS為碳源的培養液中，干酪乳桿菌的GI為92.93，大于以IMO為碳源的培養液中干酪乳桿菌的GI，且以FOS為碳源的培養液的pH值高于Glc組，低于IMO組。生長指數較高的低聚糖碳源被認為對益生菌的益生元效果更好，因此2%FOS對干酪乳桿菌的益生效應優于2%IMO。

1.4.2不同濃度FOS對干酪乳桿菌的增值效應

無糖MRS培養基中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%(w/v)FOS作為碳源，干酪乳桿菌經12 h發酵后培養液的OD600和pH值如圖2所示。

由圖2可知，當FOS濃度<2%時，隨著FOS濃度的增加，培養液發酵12 h的OD600逐漸增大，pH值逐漸降低；FOS濃度達到2%時，OD600達最大值2.69，pH值為4.02；繼續增加FOS濃度到4%，培養液發酵12 h的OD600及pH值均無明顯變化。因此，FOS作為碳源促進干酪乳桿菌的增殖效果較好濃度為2%。

2 實驗項目的組織與實施

本實驗內容屬于研究性實驗項目，在教學方法上支持學生研究性學習、主動探索和實踐、分析并解決問題，其目的是讓學生獨立思考、自主學習，啟發學生的科研思維并培養其綜合能力。研究性教學的指導思想就是把科研的過程轉化為本科教學的實踐，目的是為本科教學體系打下科學研究的基礎[10]。本實驗的實施過程分為3個階段。

注：小寫字母表示實驗結果的顯著性差異(P<0.05)圖2 干酪乳桿菌以不同濃度FOS為碳源發酵12 h的生長曲線和pH值曲線Fig.2 Growth curve and pH curve of L.casei fermented for 12 hours with different concentrations of FOS

2.1課前開展分組討論并確定實驗方案

以24人教學班為例，學生2人一組，共分為12組，按實驗條件設置2個項目任務，每6組同學對應相同實驗任務開展實驗。在實施的過程中，學生在教師的指導下，圍繞具體的項目任務，以團隊的形式分工合作來開展實驗項目。教師在開課前兩周布置項目任務及主要內容，強調注意事項。要求每位學生參與查閱文獻資料，先在小組內開展分析、討論，結合所查文獻和已掌握的實驗操作技能初步設計實驗方案。

教師在開課前一周統一組織課堂討論，按照實驗的可行性、準確性等要求對各組實驗方案進行審查，指出實驗方案的優缺點。學生利用接下來的一周時間修訂實驗方案，教師課前再次檢查并確定實驗最終方案[11]。

2.2在課堂實施過程帶入研究理念

本項目采取研究性的項目教學法，學生同時兼任實驗項目的管理者和執行者，學生由被動學習變為主動學習，教師由課堂教學的講授者、主導者變為引導者。各小組按照經確定的實驗方案開展實驗，在實驗過程中，隨堂巡視的教師不少于3位，每位教師負責8位左右學生，小組成員分工合作，合理安排任務，實驗過程中遇到的困難，先在小組內討論解決辦法，再尋求隨堂教師幫助。教師對學生實驗的各個環節進行跟蹤點評，提醒學生關注每個實驗單元的實驗原理和規范實驗操作手法，引導學生觀察益生菌生長指標的變化規律，比較添加的益生元種類及添加量對益生菌生長曲線及pH值曲線的影響，提示學生注意不同檢測指標之間的聯系，分析實驗過程中數據的變化規律和蘊含的生物學機理，以此方式將科學研究的理念帶入課堂，把研究性的項目教學法在本科實驗課堂上落實并拓展[12]。

2.3綜合分析實驗結果并以研究論文的形式呈現

實驗完成后，學生對實驗結果進行比較與討論，分析實驗結果是否達到課程要求的研究目標，總結整個實驗過程，找出實驗成敗的關鍵環節及實驗操作關鍵點，實驗報告以可正式發表的研究論文形式呈現，以此訓練學生的科技論文寫作能力。教師對學生的操作技能、結果分析能力、論文寫作能力等方面進行綜合評定[13]。以自愿或推薦的方式選出4組進行總結交流，這4組同學分別制作PPT向全體學生和教師展示實驗過程、數據分析和結果的推理論斷，報告會上鼓勵交流、隨時提問，以此積累口頭表達和學術交流經驗[14]。

3 結束語

探索性實驗項目在本科教學中引發了學生對學科研究的興趣，每個實驗環節相對獨立，但數據間又有聯系，前一環節的實驗數據與后續的實驗數據互相印證，這種數據對比性較強的實驗項目，使得學生對實驗數據精確性的重視程度增強，從而提高了實驗結果的準確性。

課程教學采取科學研究的方法，教師為學生搭建交流探討的平臺，營造互幫互助的教學氛圍，從提出問題到解決問題的全過程模擬科研過程，把傳統的“以課程為中心”的實驗教學切換為“以問題為中心”，學生通過探索性實驗將實驗操作單元與理論知識融會貫通，知識把握更加系統，更重要的是培養學生利用科研思維進行自主研究的能力及團隊合作精神，使其順利開啟職業生涯并盡快適應社會。