ESCC基因表達譜分析與KRT家族基因的鑒定

任 婧，王登奎，楊瑞娜，袁小志，劉志偉，王新帥

食管癌是全球第七大常見癌癥和第六大癌癥死亡原因[1]。食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)作為食管癌的主要亞型，在亞洲部分地區所有食管癌病例中占90%以上[2]。ESCC是一種惡性疾病，由于缺乏與診斷、治療及預后相關的生物標志物，ESCC患者的總體預后差，5 a總生存率低至15%～25%[3]。因此，揭示ESCC發生和發展的分子機制,鑒定更敏感和特異的分子標志物勢在必行，以期改善ESCC的早期診斷和預后。針對此現狀，本研究基于TCGA數據庫對ESCC和正常食管上皮組織的基因表達譜進行差異分析，發現KRT(Keratin,角蛋白)家族基因在ESCC的發生、發展及預后中的作用，這將為 ESCC 患者提供潛在的生物標志物。

1 材料方法

1.1 數據來源及處理食管鱗狀細胞癌(ESCC)基因表達數據及臨床信息來自THE UCSC XENA (http://xena.ucsc.edu/)在線數據庫下載獲得的TCGA數據庫中的食管癌信息，包括82個ESCC組織和11個正常食管上皮組織。基于Rstudio軟件(4.0.4版本)將得到的樣本數據進行標準化、去除缺失值、探針與基因轉化等處理，將處理獲得的食管樣本表達數據進行后續分析。

1.2 差異基因鑒定基于R語言軟件包Limma包對ESCC和正常組織表達矩陣數據進行差異分析，以“FDR<0.05及|logFC|≥1”為差異基因篩選條件，得到顯著差異表達基因矩陣，并用ggplot2繪制可視化火山圖。

1.3 GO和KEGG富集分析DAVID是一個功能注釋、可視化和集成發現的數據庫。本研究使用DAVID(http://david-d.ncifcrf.gov/)數據庫對顯著差異表達基因進行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)功能注釋，并通過R語言將富集分析結果可視化。GO包括生物學過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。

1.4 PPI網絡構建及關鍵基因鑒定STRING (https://string-db.org/)數據庫用于評估基因之間的量化關系。Cytoscape軟件是一款強大的可視化和分析軟件,用于繪制蛋白-蛋白相互作用(protein protein interaction,PPI)網絡。采用Cytohubba中MCC拓撲分析方法分析基因之間的量化關系，基于Rank排序鑒定出關鍵基因。

1.5 關鍵基因生存預后及表達量分析為探究關鍵基因與ESCC患者生存預后的關系及其在ESCC患者中的表達量變化，本研究應用在線數據庫THE KAPLAN-MEIER PLOTTRT(http://kmplot.com/analysis/index.php p=background)及UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/)數據庫分別進行生存預后分析和表達量驗證分析。

1.6 關鍵基因PPI網絡預測GENEMANIA(http://genemania.org/)是一個預測基因的蛋白相互作用和基因功能的數據庫[4]。該數據庫使用生物信息學方法顯示出基因的基因共表達、物理相互作用、基因共定位、基因富集分析，同時有位點預測的功能。本研究通過GENEMANIA預測了關鍵基因的相互作用網絡，并可視化分析。

1.7 統計方法以P<0.05為有顯著統計學差異，本研究統計及分析采用R語言下Rstudio及相關軟件包。

2 結果

2.1 數據準備及差異表達基因鑒定通過在線網站及R語言處理，將下載得到的93個樣本數據(82個ESCC組織及11個正常組織)進行標準化、探針與基因轉化等，得到19 560個基因表達矩陣，接著對基因表達矩陣進行差異分析，以“FDR<0.05及|logFC|≥1”為差異基因篩選條件，共得到708個顯著差異基因(335個上調差異基因和373個下調差異基因，圖1)，其中紅點代表上調差異基因，綠點代表下調差異基因。

圖1 差異表達基因火山圖

2.2 差異表達基因富集分析基于DAVID數據庫對708個顯著差異基因進行GO和KEGG富集分析。如圖2，GO富集分析揭示差異基因在生物學過程、細胞成分和分子功能方面主要參與蛋白酶解、角化細胞分化、角化作用、角蛋白絲、消化作用、質膜組成部分、表皮結構成分、絲氨酸型內肽酶抑制劑活化、絲氨酸肽鏈內切酶活化等；KEGG富集分析顯示，差異基因主要與蛋白質消化吸收、細胞色素P450相關生物代謝、神經活性配體-受體的相互作用等通路相關。

圖2 差異表達基因富集分析

2.3 關鍵基因鑒定將708個顯著差異基因上傳至STRING數據庫得到基因之間的量化關系，并通過Cytoscape進行可視化分析，采用Cytoscape中的MCC算法獲得前30顯著差異基因網絡圖，根據Rank=1的節點基因確定為關鍵基因(圖3)。本研究所確定的關鍵基因KRT9、KRT84、KRT82、KRT81、KRT79、KRT6B、KRT5、KRT3、KRT16等，均為KRT家族基因。

圖3 關鍵基因PPI網絡

2.4 關鍵基因預后及表達量分析將上文鑒定的關鍵基因通過KAPLAN-MEIER PLOTTER數據庫進行生存預后分析，發現KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79基因高表達與ESCC患者預后差顯著相關(圖4)。本研究進一步通過UALCAN數據庫分析了KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79基因在ESCC中的表達量分析，結果如圖5所示，對比食管腺癌和正常食管組織，KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79基因在食管鱗癌中高表達。

圖4 KRT基因OS評估

圖5 KRT基因在食管鱗癌、食管腺癌和正常組織中差異表達

2.5 關鍵基因PPI網絡預測GENEMANIA數據庫預測的關鍵基因PPI網絡揭示出KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79基因主要參與角質化、皮膚發育、角化細胞分化和表皮細胞分化(圖6),支持KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79的功能涉及角化細胞分化。

圖6 KRT基因PPI網絡預測

3 討論

ESCC是中國癌癥相關死亡的第四大原因[4]。ESCC的發生原因和潛在機制仍是一個世界性難題[5]。用于預測不同腫瘤的潛在生物標志物的基因分析或微陣列技術是癌癥研究的新方式。本研究通過差異分析對比從TCGA數據庫獲得ESCC和正常食管組織基因表達譜，鑒定出708個顯著差異表達基因。發現差異基因主要參與角化細胞分化、角蛋白絲、表皮結構成分等生物學通路，且差異基因中的KRT家族基因在調控ESCC中發揮著重要作用。生存預后結果提示KRT家族基因中KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79(上調關鍵基因)高表達與ESCC患者預后差顯著相關，并通過對比食管正常組織及食管腺癌，再次證實KRT5、KRT6B、KRT16及KRT79在ESCC中起著上調作用。

KRT基因編碼一組不同的中間絲蛋白，其編碼蛋白構成上皮細胞的細胞骨架，惡性腫瘤細胞常起源于這些上皮細胞[6-7]。既往研究報道KRT可能在細胞凋亡、細胞生長、上皮極性、傷口愈合和組織重塑中發揮作用[8]。最新研究表明，KRT基因是上皮細胞中最常見和特異表達的基因，其在不同癌癥中的表達異常影響細胞增殖、侵襲和遷移[9]。在尿路上皮細胞、乳腺和肺癌方面，KRT 經常被用來確定癌細胞的起源，為診斷提供一定的指導[10]。KRT還參與細胞信號轉導調節、蛋白質合成和極化細胞結構的維持等[11]。

KRT5已被用作單獨的標記物或與KRT6組合(KRT5/6)作為鱗癌抗原特異性免疫組化診斷的一部分[12-14]。膀胱癌中，KRT5/6 和 KRT20作為一種組合標志物用于免疫組化分析，可幫助臨床評估患者化療受益情況[15]。SK-OV-3細胞中KRT5基因缺陷可阻止細胞遷移[16]。具有鱗狀分化小鼠的肌細胞中KRT5的表達與Trp53突變會導致浸潤性膀胱癌發生率更高[17]。肝癌細胞中，KRT6B過表達可促進癌細胞增殖并表現出抗凋亡作用，且KRT6B是Notch信號傳導的關鍵介質可能參與腎細胞癌的發生、進展和預后[18-19]。KRT6/16/17角蛋白的上調會改變角質形成細胞的增殖、細胞黏附、遷移和炎癥特征，導致角質形成細胞過度增殖和先天免疫激活以響應表皮屏障破壞[20]。KRT16參與遺傳性皮膚病、銀屑病和癌癥相關的上皮炎癥發生，沉默KRT16通過抑制ERK信號通路來抑制銀屑病中角質形成細胞的增殖和血管內皮生長因子的分泌[21-22]。肺癌中KRT16過表達可促進腫瘤發生，并且 KRT16 表達可以作為獨立的預后標志物[23]。 研究證實KRT79參與角化、發育生物學和啟動了毛管形態發生和再生[24]，其在癌癥中的生物學功能尚不清楚，進一步研究顯得尤為必要。

綜上所述，本研究通過分析TCGA數據庫中的ESCC樣本，發現KRT家族在ESCC發生、發展中發揮重要作用，且KRT5、KRT6B、KRT16及KRT79與ESCC預后顯著相關。由于KRT家族基因在ESCC中的研究較少，本研究可為ESCC研究提供一定的理論依據。