S/R構型煙堿與胃膜素的作用機制

楊 繼，朱瑞芝，向能軍，司曉喜，何 沛，劉春波，唐石云，張鳳梅，王 強，劉志華，蔡炳彪*

1.云南中煙工業有限責任公司技術中心，昆明市北市區紅錦路367號 650231

2.紅塔煙草（集團）有限責任公司工藝質量部，云南省玉溪市紅塔區紅塔大道118號 653100

胃膜素（Gastrin I Human，GIh）又稱胃黏膜素，是從豬胃黏膜中提取的一種以黏蛋白為主要成分的生化藥物［1］。胃膜素有重要的生理和藥理功能［2-5］。煙堿約占煙草中總生物堿的90%，是煙草制品的主要化學成分。煙堿具有兩種不同的旋光異構體，即S-（－）-煙堿和R-（+）-煙堿［6-7］。煙草中的煙堿主要為S-（－）-煙堿，R-（+）-煙堿僅占煙草原料中煙堿總量的1%（質量分數，下同）左右，但隨著燃燒過程中的熱解和外消旋作用，R-（+）-煙堿的量可達到2%～3%。許多動物實驗和體外模型實驗表明，兩者在生物體內的代謝過程有所不同，S-（－）-煙堿比R-（+）-煙堿具有更強的生理活性和毒性［7］。因此，兩種構型煙堿的分離及作用機理在藥學和吸煙與健康研究方面具有重要意義［8］。口含煙作為新型的煙草制品，已成為煙草消費的重要補充形式，日益受到關注。不同于傳統卷煙，口含煙沒有經過燃燒過程，而是經口腔咀嚼或口含來吸食，通過味覺消費。其煙堿攝入由傳統卷煙煙絲燃燒-上呼吸道攝入模式轉向口腔-胃腸消化道攝入模式。一部分煙堿透過口腔黏膜被吸收后進入血液使人產生生理滿足感；另一部分轉入胃腸道吸收，并與胃腸道內生物大分子發生相互作用。攝入模式的改變導致煙堿在體內外的溶出和吸收規律發生變化，因此必須重新認識煙堿在口腔及胃腸道中的釋放、吸收、滲透、擴散行為及影響因素。同時，研究S-（－）-煙堿和R-（+）-煙堿與消化道胃腸部位關鍵生物大分子相互結合方式及影響因素，以了解不同構型煙堿的生物活性，對深入了解煙堿的作用機理具有重要意義。因此，本研究中從實驗角度對S/R型煙堿與GIh 的結合行為進行對比考察，總結出配體分子的構型對結合過程的影響，旨在探究不同構型煙堿在人體內與生物蛋白的相互作用，為新型煙草的產品開發、質量控制及安全性評價提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

胃膜素（96%～99%，美國Sigma-Aldrich 生物技術公司）：S型煙堿（陜西港華生物科技有限公司）；R型煙堿（＞99%，加拿大TRC 化學品公司）；PBS 緩干粉（AR，杭州昊鑫生物科技股份有限公司）；超純水［自制，電阻率18.2 MΩ·cm（25 ℃）］。

Cary Eclipse 分子熒光光譜儀（美國Varian 公司）；FluoroLog-3 時間分辨熒光光譜儀（法國Horiba 公司）；Aviv Model 400 圓二色譜儀（美國Aviv 公司）；BS224S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；YASARA v16.7.22 軟件（美國Scripps 研究所Olson 實驗室）；Milli-Q 超純水制備儀（法國默克化工技術公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液制備

（1）PBS 緩沖液：將一包PBS 緩干粉固體全部倒入燒杯中，用超純水溶解并定容至2 L 容量瓶中，得pH=7.4、濃度為0.01 mol/L 的PBS 緩沖液。

（2）GIh 儲備液：準確稱取5 mg GIh，用pH=7.4的PBS 緩沖液定容至100 mL，即得2.0×10-5mol/L的GIh 儲備液。

（3）S/R型煙堿（S/R-Nic）儲備液：準確吸取16 μL 煙堿，用PBS 緩沖液溶解并定容于10 mL 容量瓶中，得0.01 mol/L 的煙堿儲備液。用錫紙包裹容量瓶避光放置。

1.2.2 分子熒光光譜法

取6 只2 mL 的離心管，分別加入250 μL 2.0×10-5mol/L 的GIh 儲備液，然后再分別加入0、20、80、160、320 和480 μL 的煙堿儲備液，最后依次加入pH=7.4 的PBS 緩沖液750、730、670、590、430和270 μL。忽略溶液混合帶來的體積誤差，配制成1 mL 的混合溶液，使得GIh 最終濃度為5.0×10-6mol/L，煙堿最終濃度分別為0、0.2×10-3、0.8×10-3、1.6×10-3、3.2×10-3和4.8×10-3mol/L，置于旋渦混合器上使其混合均勻，避光置于恒溫水浴鍋中，30 min 后進行熒光發射光譜測定。設定測試樣品溫度為298 和310 K，激發波長為280 nm，激發與發射的夾縫寬度分別為20 和10 nm，測定范圍為300～500 nm，記錄熒光發射光譜的峰值強度。

1.2.3 時間分辨熒光光譜法

配制兩份試樣溶液：按比例混合GIh 儲備液和煙堿儲備液，并以PBS 緩沖液定容，使得GIh 最終濃度為5.0×10-6mol/L，煙堿濃度分別為0 和8.0×10-4mol/L，置于旋渦混合器上使其混合均勻，靜置30 min 后進行熒光測定。激發波長和發射波長分別設定為280 和338 nm，測定溫度為298 K。

1.2.4 同步熒光光譜法

測定發射波長與激發波長差值分別為15 和60 nm（Δλ=15、60 nm）條件下的熒光強度。在Δλ=15 nm 的同步熒光實驗中，掃描范圍為200～600 nm，激發夾縫寬度為5 nm，發射狹縫寬度為20 nm，GIh 和S型/R型煙堿的混合溶液濃度為分子熒光光譜法實驗中溶液的1/10。在Δλ=60 nm 的同步熒光實驗中，設定掃描范圍為200～400 nm，激發夾縫寬度為20 nm，發射狹縫寬度為10 nm，GIh和S型/R型煙堿的混合溶液樣品配制方法與熒光發射光譜一致。

1.2.5 三維熒光光譜法

按1.2.3 節的方法配制兩份試樣溶液，靜置30 min 后進行三維熒光光譜測定。設定激發波長范圍為200～500 nm（間隔為10 nm），發射波長范圍為200～500 nm，激發與發射的夾縫寬度分別為20和10 nm，溫度為室溫。

1.2.6 圓二色光譜法

按1.2.3 節的方法配制兩份試樣溶液，靜置30 min 后進行圓二色光譜測定。設置步長為1 nm，掃描范圍為190～280 nm，每個樣品重復掃描3 次，取平均值。

2 結果與討論

2.1 熒光淬滅及淬滅機理的研究

熒光是物質吸收光照或其他電磁輻射后發出的光。光照射某些原子時，光的能量使原子核周圍的一些電子從基態躍遷到激發態。激發態具有較高能量而不穩定，可通過多種途徑釋放能量再回到基態，其中，以光量子發射形式的能量釋放，可產生熒光。用熒光光譜技術分析的樣品，首先要有含吸光結構的熒光物質［9］。蛋白質分子中的內源性熒光主要來自Trp（色氨酸，348 nm）、Tyr（酪氨酸，303 nm）和Phe（苯丙氨酸，282 nm）3 種氨基酸殘基。Trp、Tyr 和Phe 之間的熒光強度比為FTrp∶FTyr∶FPhe=100∶9∶0.5，且Phe 氨基酸殘基在水溶液中多以離子形式存在，其熒光量子產率較低，對蛋白質水溶液的熒光貢獻難以觀測得到，且同一蛋白分子中的Phe 和Tyr 吸收的能量通常會傳遞給Trp，因此，蛋白質分子水溶液多表現為Trp 的熒光特性［9-10］。通常認為，當有機小分子與蛋白受體結合后，會影響該蛋白發色團周圍的微環境，在光譜上直觀地表現出蛋白的內源性熒光發生淬滅，通過利用蛋白熒光強度與有機小分子濃度之間的關系進行相關定性和定量研究，從而得到激發光譜、發射光譜以及熒光強度等物理參數，和結合機理、結合模式、結合常數、結合位點數以及分子間的距離等分子間相互作用信息［11-12］。因此熒光光譜法成為研究小分子藥物與蛋白之間相互作用的重要手段之一。

在本實驗中，首先考察激發波長的選擇。常選擇280 和295 nm 作為蛋白質溶液的激發波長（λex）。當λex為280 nm 時，Trp、Tyr 和Phe 均被激發，主要考慮蛋白質分子整體受外加物質或試劑的影響；當λex為295 nm 時，得到的熒光譜圖顯示為Trp 熒光特征。因此本研究中考察兩種激發波長。S型和R型煙堿分別與GIh 結合的熒光強度淬滅的歸一化情況見圖1。可以看出，隨S型/R型煙堿的不斷加入，GIh 的熒光強度逐漸降低，即發生了熒光淬滅現象，表明S型和R型煙堿分子均與GIh 之間存在相互作用。對比280 和295 nm 兩種激發下的熒光淬滅效果發現，無論是S型還是R型煙堿，均在280 nm 的激發波長下有比較大的熒光淬滅，因此選擇此激發波長更有利。同時，對于S型煙堿來說，280 nm 激發波長下熒光淬滅比295 nm 強很多；而對于R型煙堿來說，280 nm 激發波長下熒光淬滅比295 nm 激發下僅有微弱優勢。因此也可以判斷出，S型煙堿與GIh 的結合對蛋白內部的3 種含有熒光發色團的氨基酸均有影響，而R型煙堿主要對色氨酸殘基有影響。

圖1 280 和295 nm 激發波長下S 型/R 型煙堿對GIh 在338 nm 處熒光強度淬滅的歸一化圖Fig.1 Normalized diagram of fluorescence intensity quenching of GIh at 338 nm induced by S/R-nicotine at excitation wavelengths of 280 and 295 nm

不同濃度的煙堿溶液對GIh 的熒光淬滅情況如圖2 所示。GIh 的最大熒光發射峰約出現在358 nm 位置，隨著S型/R型煙堿的不斷加入，GIh的熒光強度逐漸降低，即發色團的熒光發生了淬滅，并由此可斷定煙堿與GIh 間發生了相互作用，且煙堿均與GIh 存在一定程度的結合。同時，可以看出加入相同濃度的S型和R型煙堿，S型對GIh的熒光淬滅強度均比R型煙堿強很多，因此也可以初步判斷S型煙堿與GIh 的作用強度大于R型。

圖2 298 K 下S 型/R 型煙堿與GIh 作用的熒光發射譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of S/R-nicotine acting on GIh at 298 K

熒光淬滅主要指動態淬滅和靜態淬滅兩種。判斷一個淬滅過程是動態還是靜態，可以依據其對溫度的依賴性。當溫度升高時分子之間的碰撞會加劇，導致動態淬滅常數增加；而在靜態淬滅機理下形成的復合物會發生解離，從而導致淬滅常數下降。考慮到內濾效應的影響，為確保實驗結果的準確性，本研究中用于分析計算的熒光數據均采用文獻中使用較多的公式（1）進行數據校正。

式中：Fcor和Fobs分別為校正后和實驗實測的熒光強度；A1和A2分別為GIh 和不同濃度的煙堿混合溶液在激發和發射波長下的紫外吸光度，Abs。后續數據處理均使用校正后的數據。本研究中采用Stern-Volmer 方程（2）在不同溫度（298 和310 K）下的線性擬合分析熒光淬滅類型［12］。

式中：F和F0分別為煙堿存在和不存在時GIh的熒光強度；Kq為熒光淬滅速率常數，L/（ns·mol）；τ0為GIh 的平均熒光壽命（298 K 下，τ0值為2.13 ns，由時間分辨熒光實驗測定，見表1）；［Q］為煙堿的濃度，mol/L；Ksv為Stern-Volmer 淬滅常數，L/mol。

在不同溫度下，F0/F對［Q］的線性回歸分析擬合曲線見圖3。可知，不同溫度下的Stern-Volmer曲線線性關系良好。根據公式（2）計算得到的淬滅常數Ksv以及淬滅速率常數Kq見表1。可以看出，隨溫度升高，S型和R型煙堿對GIh 的淬滅常數Ksv逐漸減小，這表明兩種構型煙堿和GIh 相互作用的過程為靜態淬滅，有復合物形成［13］。此外，S型和R型煙堿在不同溫度下的淬滅速率常數Kq值均大于最大散射碰撞淬滅速率常數值［2.0×1010L/（s·mol）］，這進一步表明，無論是S型還是R型煙堿與GIh 之間相互作用的淬滅機理均為靜態淬滅。

圖3 S 型和R 型煙堿與GIh 作用體系在不同溫度下的Stern-Volmer 擬合結果Fig.3 The Stern-Volmer plots of F0/F for GIh against S/R-nicotine at two different temperatures

表1 S 型和R 型煙堿與GIh 作用體系在不同溫度下的Stern-Volmer 熒光淬滅常數Tab.1 Fluorescence quenching constants of S/R-nicotine and GIh systems in Stern-Volmer equation at different temperatures

動態、靜態淬滅的區分也可通過對比加入煙堿前后GIh 的熒光壽命實現。若S型/R型煙堿與GIh 之間的淬滅類型為動態淬滅，隨著煙堿濃度增加，碰撞增加，GIh 熒光壽命衰減更快，表現為GIh熒光壽命減小；若S型/R型煙堿與GIh 之間的淬滅類型為靜態淬滅，煙堿和GIh 形成無熒光或弱熒光復合物，不會改變GIh 激發態的熒光壽命。圖4為加入S型/R型煙堿后GIh 的熒光衰減曲線，可知，S型和R型煙堿加入后，均未使GIh 的熒光壽命發生較為明顯的變化。此外為了對結果進行定量分析，通過雙指數迭代擬合（Bi-exponential iterative fitting）處理該體系的時間分辨熒光衰減數據，見公式（3）［14-15］，結果見表2。

使用卡方檢驗（χ2）評估擬合結果的性能，若χ2<1.3，則擬合結果在可接受的容忍區間內。通過熒光衰減時間（τ1、τ2、τ3）和正交化指前因子（α1、α2、α3）可計算其平均熒光壽命（τ）。由表2 可知，χ2<1.15，表明擬合結果可信。PBS（pH=7.4）緩沖溶液中熒光衰減曲線擬合熒光壽命參數見表2。空白GIh 的加權平均熒光壽命為2.13 ns，分別加入蛋白與配體的物質的量比為1∶160 的S型、R型煙堿后，GIh 的加權平均熒光壽命為2.01 和1.94 ns。S型/R型煙堿-GIh 作用體系未發生動態淬滅，結合圖4 可以確定S型/R型煙堿與GIh 作用形成有非熒光或弱熒光復合物。若將儀器誤差考慮在內，并除去高濃度S型/R型煙堿與蛋白形成復合物的熒光壽命的影響，空白GIh 的熒光壽命未變。因此，進一步明確S型/R型煙堿與GIh 之間的淬滅機理均為靜態淬滅。

圖4 S 型/R 型煙堿與GIh 相互作用的時間分辨熒光Fig.4 Time-resolved fluorescence of S/R-nicotine and GIh

表2 S 型/R 型煙堿與GIh 體系的熒光衰減曲線擬合參數Tab.2 Fitting parameters of fluorescence lifetime curve of S/R-nicotine and GIh system

2.2 結合常數及結合位點數

當S型/R型煙堿與GIh 之間的淬滅機理均為靜態淬滅時，假定小分子配體S型/R型煙堿在GIh上有n個相同且獨立的結合位點，那么熒光強度、淬滅劑的濃度與結合常數及結合位點數之間的關系符合雙對數方程，即修正過的Stern-Volmer 方程，也稱為雙對數曲線［16-17］。

式中：Ka為小分子配體與蛋白的結合常數，L/mol；n（斜率）表示結合位點數。lg［（F0-F）/F0］對lg［Q］的擬合曲線見圖5，計算結果見表3。從Ka值分析，S型和R型煙堿與GIh 形成基態復合物的能力均較弱，說明煙堿不易與GIh 發生結合，或生成煙堿-GIh 復合物的穩定性差。結合常數均表現出隨溫度升高而增加的趨勢，表示升高溫度均有利于復合物的生成。同時可以發現在兩個溫度下，S型煙堿與GIh 的結合常數均比R型煙堿強，說明在模擬人體環境下，S型煙堿更易與GIh 發生結合并形成基態復合物。

圖5 不同溫度下S型和R型煙堿-GIh體系的lg［（F0-F）/F0］對lg［Q］擬合曲線Fig.5 Fitting curves of lg［（F0-F）/F0］to lg［Q］for S/R-nicotine-GIh systems at different temperatures

表3 不同溫度下S 型/R 型煙堿與GIh 結合的相關參數Tab.3 Binding constants of S/R-nicotine and GIh at different temperatures

2.3 作用力類型

有機小分子與蛋白質之間的結合依賴弱的非共價作用力，其類型主要包括氫鍵、靜電作用、疏水作用和范德華力等［18］。Ross 和Sun 根據大量的實驗和理論［19-20］，總結出了判斷蛋白質與小分子結合作用力類型與熱力學函數之間的關系。由Van’t Hoff 方程（5）和Gibbs-Helmholtz 方程（6），可根據不同溫度下結合常數的變化計算得到有機小分子與蛋白質的相互作用熱力學參數。

式中，T為實驗溫度，K；Ka為相應溫度下的結合常數，L/mol；R 為摩爾氣體常數，J/（mol·K）；ΔH為焓變，kJ/mol；ΔS為熵變，J/（mol·K）；ΔG為吉布斯自由能，kJ/mol。

在溫度變化不大時，一般認為ΔH為恒定值，分子間的相互作用力類型可由ΔS判斷：ΔH<0，ΔS>0，為靜電作用力；ΔH>0，ΔS>0，為典型的疏水作用力；ΔH<0，ΔS<0，為氫鍵和范德華力［18，21］。S型/R型煙堿與GIh 作用體系的Van’t Hoff 擬合曲線如圖6 所示，擬合結果列于表4。ΔG為負值表明S型煙堿和R型煙堿與GIh 的相互作用是一個自發的過程，且ΔH、ΔS均為正值，表明疏水作用力在該相互作用體系的結合中占主導地位。

圖6 S型/R型煙堿與GIh作用體系的Van’t Hoff擬合曲線Fig.6 Van’t Hoff fitting lines of the interaction system of S/R-nicotine and GIh

表4 不同溫度下S 型/R 型煙堿與GIh 結合的相關參數Tab.4 Thermodynamic parameters of S/R-nicotine and GIh at different temperatures

2.4 S型/R型煙堿與GIh結合對構型和構象的影響

當S型/R型煙堿與GIh 發生相互作用時，由于分子間或分子內作用力的改變，會導致蛋白的二級或三級結構發生改變，進而影響蛋白質的整體構象。本實驗中，利用同步熒光光譜、三維熒光光譜和圓二色光譜分析了由S型/R型煙堿引起的GIh 的微環境變化和結合引起的煙堿構型的改變。

（1）同步熒光光譜

同步熒光光譜同時掃描激發和發射兩個單色器波長，得到熒光信號強度與激發波長（或發射波長）相對應的熒光譜圖。一般按掃描方式不同，分為恒波長、恒能量、恒基體和可變角法［22］。在有機小分子與蛋白質結合過程中，常用恒波長法，設定發射波長對激發波長的增數恒定（即Δλ=λem-λex，為常數），該增數不同，會導致同步熒光光譜反映出蛋白質分子內源性熒光發色團氨基酸殘基周圍不同的微環境，例如當Δλ=60 nm 時表現為Trp 氨基酸殘基的熒光；Δλ=15 nm 時表現Tyr 氨基酸殘基的光譜特征。該方法的優勢在于將內源性熒光發色基團（對蛋白質而言，為Trp、Tyr 和Phe）的峰譜重疊從發射峰中區分出來，能簡明觀測到有機小分子的進攻對蛋白質特定氨基酸殘基周圍微環境的影響。

圖7 為S型/R型煙堿與GIh 作用的同步熒光譜圖。當Δλ=15 nm 時，滴加S型/R型煙堿并未看到兩個同步熒光峰有明顯位移，表明GIh 的發色團微環境（疏水或親水性）未受S型/R型煙堿加入的影響。當Δλ=60 nm 時，在測試濃度范圍內S型/R型煙堿的加入使GIh 在280 nm 處的同步熒光峰輕微降低且有一定程度的紅移；而在350 nm 前后的同步熒光峰表現出明顯的熒光增強現象和紅移，表明S型/R型煙堿的加入主要對色氨酸殘基本身的熒光和周圍微環境產生明顯影響，增加了色氨酸殘基周圍的極性并降低了疏水性。且通過對比兩種煙堿異構體可以發現，S型煙堿對色氨酸和酪氨酸殘基均有影響，而R型煙堿主要對色氨酸周圍微環境影響較大。

圖7 Δλ=15、60 nm 時不同S 型/R 型煙堿濃度下GIh 的同步熒光光譜圖Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of S/R-nicotine and GIh at Δλ=15，60 nm

（2）三維熒光光譜

三維熒光是通過固定激發（或發射）波長來掃描發射（或激發）波長得到熒光強度隨波長變換的二維平面圖。三維熒光技術同時考慮激發和發射兩個函數的變化，能夠獲得兩個波長同時變化的熒光圖譜，繪制得到的立體三維投影圖分別以x、y、z軸作為發射波長（λex）、激發波長（λem）和熒光強度，可直接觀察到蛋白特征峰位置和高度的光譜學特性，并根據λex，λem和熒光強度及峰形變化等參數考察蛋白質的構象變化［23］。在三維熒光譜圖的特征峰為二倍銳利散射峰Peak A（λex=2λem），銳利散射峰Peak B（λex=λem），蛋白多肽骨架特征峰Peak 1（π→π*躍遷引起，λex/λem=225 nm/340 nm附近）以及Trp 和Tyr 氨基酸殘基n→π*躍遷峰Peak 2（λex/λem=280 nm/350 nm 附近）［24］。該熒光法得到的蛋白質構象的熒光信息相對全面。

圖8 為空白GIh 和加入S型/R型后的煙堿-GIh 體系的三維熒光的二維輪廓圖。S型和R型煙堿的加入使Peak 1 分別下降了約1.45%和9.46%，變化很小，且斯托克斯（Stokes）位移幾乎未移動，表明煙堿與GIh 發生了結合，但基本不影響蛋白多肽骨架。對于Peak 2 來說，S型和R型煙堿的加入分別使熒光強度增加了64.07%和96.13%，并伴有較大的斯托克斯位移（表5），說明對Trp 和Tyr 氨基酸殘基的微環境影響較大，且R型煙堿的影響更大。該結果與同步熒光結果一致，不僅能證明蛋白的構象變化，也能輔助說明同步熒光光譜結果的可信度。

表5 GIh 和S/R 型煙堿-GIh 體系的三維熒光光譜參數Tab.5 Three-dimensional fluorescence spectrum parameters of GIh and S/R-nicotine-GIh systems

圖8 煙堿-GIh 體系三維熒光的二維輪廓譜圖Fig.8 Two-dimensional fluorescence profile of GIh and S/R-nicotine-GIh systems obtained from three-dimensional fluorescence

（3）圓二色光譜法

圓二色譜法從1960 年開始被廣泛用于蛋白質、多肽等生物大分子的二級結構信息研究。其測試原理是利用化合物使平面偏振光變成橢圓偏振光的圓二色性［25］。對于蛋白質而言，其中的不對稱氨基酸殘基提供了剛性的肽鏈骨架和自由旋轉的α-碳側鏈，氨基化合物基團經偏振光后，會在遠紫外區域波段存在n→π*和π→π*躍遷，從而影響多肽骨架的幾何結構，蛋白質由于氨基酸序列及氨基酸殘基周圍微環境的不同呈現出不同的二級結構形態，掃描樣品圓二色譜（蛋白質樣品多為190～260 nm 遠紫外區域），可得到二級結構的不同組成部分［25-26］。例如，α-螺旋的在190 nm 附近（π→π*）有一個較高正峰，208 nm（π→π*）和220 nm（n→π*）附近有兩個程度相近的負峰；β-折疊會隨蛋白質主螺旋結構的不同而產生不同的方向性，故特征峰型及位置會有所不同，多數在195～202 nm 有正峰信號，在215～220 nm 有負峰信號；β-轉角在180～190 nm 有一個寬幅吸收帶（常因溶液效應而在實際圖譜上觀察不到），200～205 nm（π→π*）和225 nm（n→π*）有負峰；而無規則卷曲構象則在200 nm 附近有負信號［27-28］。

由圖9 可明顯看出，S型和R型煙堿有明顯的圓二色性，因此，在為了消除煙堿的影響，對反應后的樣品峰進行了差譜處理。對比空白S型/R型煙堿及其差譜峰（圖9a）可以發現，S型和R型一直是呈對稱分布的，且差譜后的峰與空白峰相比呈現倒峰關系，具有一定的規律性。原因可能是S型和R型煙堿與GIh 之間發生相互作用后兩種構型的煙堿發生異構化，在結合中發生了構型的翻轉，這表明煙堿與生物大分子的結合可能是由構型翻轉誘導的［29］。此外，圖9b 顯示的是單獨GIh的圓二色圖譜，可以看到GIh 在測試范圍（190～280 nm）內均呈現負吸收，且在208 和212 nm 處有兩個負蜂，這是α-螺旋的特征峰，屬于螺旋結構中肽鏈上n→π*和π→π*的躍遷。用平均殘基橢圓率（Mean residueellipticity，MRE）計算圓二色譜結果，其單位為deg·cm2·dmol-1，計算公式如下：

圖9 煙堿-GIh 體系的圓二色光譜圖Fig.9 Circular dichroism of nicotine-Gih system

式中：cp是蛋白的濃度，mol/L；n為蛋白的氨基酸殘基個數，17 個；l為測試皿的光徑，0.1 cm。GIh 二級結構中α-螺旋質量百分比的計算式為：

計算結果顯示，GIh 的α-螺旋的質量百分比約為38.83%。雖然目前仍未得到GIh 的單晶數據，但從CD 結果可以看出，GIh 的二級結構中含有一定量的α-螺旋結構。由于GIh 的分子量很小，圓二色信號較弱，加入兩種構型的煙堿后主要顯示出煙堿的特征吸收峰。因此，無法通過圓二色光譜法來研究S型和R型煙堿與GIh 之間的結合對蛋白二級結構的影響。

3 結論

①兩種構型的煙堿與GIh 之間均存在由疏水作用力占主導的較弱的相互作用，S型煙堿與GIh間的結合強度略強于R型，且均對溫度比較敏感，一定程度提高溫度有利于兩種構型的煙堿與GIh間的結合。②S型/R型煙堿對GIh 的熒光淬滅機理相同，均為靜態淬滅方式。③兩種構型的煙堿作用于GIh 時均會引起一定程度的氨基酸殘基周圍微環境的改變，且CD 結果顯示在與GIh 結合時具有構型翻轉的現象，表明煙堿構型對于與GIh的結合具有重要影響。