基于短小芽孢桿菌轉錄組的強啟動子鑒定

姚動邦，張康，朱昫飏，吳敬*

1(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

短小芽孢桿菌(Brevibacilluschoshinensis)是一種革蘭氏陽性菌，具有胞外蛋白酶活性低、蛋白合成與分泌能力強以及非致病性等優點[1]。相較于目前被廣泛用于蛋白表達的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，B.choshinensis不僅具有更低的胞外蛋白酶活性[2]，而且其胞外分泌蛋白質量濃度可高達30 g/L[3]，這幾乎是B.subtilis最高胞外蛋白濃度的1.5倍[4]。因此，B.choshinensis被逐漸用于重組表達目的蛋白[5-7]。然而，目前常用于B.choshinensis表達系統的強啟動子僅有P2啟動子[8]，高效強啟動子的缺乏嚴重限制了B.choshinensis表達系統的進一步開發及應用[1]。

啟動子是一個重要的基因表達調控元件，選擇高效強啟動子是促進目的基因高效表達的一種有效方法[9]。高效強啟動子可通過對已有啟動子的關鍵位點(如-35或-10區)進行修飾以及挖掘新啟動子2種方式獲得[10-11]。隨著轉錄組測序(RNA-Seq)技術的發展，目前可基于基因的mRNA含量來挖掘新強啟動子，且該方法較傳統載體陷阱捕捉的方法具有時間短、勞動成本低等優點[12-14]。因此，基于轉錄組數據挖掘新強啟動子的方法逐漸得到推廣[15]。例如，LIU等[16]基于地衣芽孢桿菌的轉錄組數據及基因的RPKM(reads per kilobase of exon model per million mapped reads)值挖掘了一個新強啟動子pBL9。當谷氨酰轉肽酶為報告蛋白時，由啟動子pBL9介導的重組酶活性是啟動子P43介導的重組酶活性的1.23倍[16]。MENG等[17]基于B.subtilis的轉錄組數據及基因的RPKM值挖掘了一個新強啟動子PsodA。當普魯蘭酶為報告蛋白時，由啟動子PsodA介導的重組酶活性是啟動子P43介導的重組酶活性的1.82倍[17]。由此可推，基于B.choshinensis轉錄組數據分析將是獲得B.choshinensis內源性新強啟動子的一種有效手段。

在本研究中，首先制備了RNA-Seq樣品并利用RNA-Seq技術獲得了B.choshinensis的轉錄組數據。然后基于轉錄組數據挖掘了B.choshinensis內源性新強啟動子。最后通過其他報告蛋白以及3 L罐發酵進一步考察了篩選到的新內源性強啟動子的通用性及有效性。本研究為B.choshinensis表達系統提供了更多的強啟動子，促進了B.choshinensis表達系統的開發與應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

菌株B.choshinensisHPD31-SP3、B.choshinensis/pNCMO2-P2-amyS(BCWPS)、B.choshinensis/pNCMO2-P2-SI(BCWPSI)及B.choshinensis/pNCMO2-P2-Cut(BCWPCUT)、重組表達載體pNCMO2-P2-amyS(pNCP2S)、pNCMO2-P2-SI(pNCP2SI)和pNCMO2-P2-Cut(pNCP2Cut)均為作者所在課題組前期保藏，其他菌株及質粒均由本研究所構建。

1.1.2 實驗試劑

DNA聚合酶，大連寶生生物工程有限公司；質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、細菌RNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；One-step Cloning kit一步克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為國產或進口的分析純級。

1.1.3 儀器與設備

PCR儀，美國Bio-Rad公司；搖床培養箱，上海知楚生物科技有限公司；3 L發酵罐，美國NBS公司；離心機，德國Eppendorf公司；可見分光光度計，北京優普通用科技有限公司；NanoDrop2000，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.1.4 培養基

TM液體培養基、TM固體培養基、SHC電轉培養基、微量金屬離子液均參考鄒亮等[18]的研究報告。3 L 罐發酵基礎培養基組分包括：15 g/L牛肉浸膏，15 g/L多聚蛋白胨，10 g/L葡萄糖，10 mL/L微量金屬離子液。3 L罐發酵補料培養基為300 g/L葡萄糖。

1.2 實驗方法

1.2.1 分子操作方法

重組載體pNCPAS、pNCPBS、pNCPCS、pNCPDS、pNCPES、pNCPFS、pNCPGS、pNCPHS、pNCPIS、pNCPJS、pNCPKS、pNCPLS、pNCPMS、pNCPNS、pNCPOS、pNCPPS、pNCPQS、pNCPRS、pNCPSS分別由啟動子PA、PB、PC、PD、PE、PF、PG、PH、PI、PJ、PK、PL、PM、PN、PO、PP、PQ、PR、PS替換重組載體pNCP2S中的P2啟動子獲得。重組載體pNCESI和pNCECut分別由啟動子PE替換重組載體pNCP2SI和pNCP2Cut中的啟動子P2獲得。不同啟動子片段分別用表1中對應的引物，依B.choshinensisHPD31-SP3基因組為模板，通過PCR獲得。載體片段pNCMO2-amyS、pNCMO2-SI和pNCMO2-Cut均是通過表1中的FP/RP為引物，分別依重組表達載體pNCP2S、pNCP2SI和pNCP2Cut為模板，通過PCR獲得。含有不同啟動子的重組表達載體是由對應的啟動子片段與載體片段pNCMO2-amyS或pNCMO2-SI或pNCMO2-Cut通過一步克隆試劑盒進行連接獲得。將含有不同啟動子的重組表達載體通過電轉化的方式轉到B.choshinensisHPD31-SP3中分別獲得對應的重組菌BCWAS、BCWBS、BCWCS、BCWDS、BCWES、BCWFS、BCWGS、BCWHS、BCWIS、BCWJS、BCWKS、BCWLS、BCWMS、BCWNS、BCWOS、BCWSP、BCWQS、BCWRS、BCWSS、BCWESI和BCWECUT。B.choshinensisHPD31-SP3的電轉感受態的制備及重組質粒的電轉化方法均參考LI等[19]的研究報告。

表1 本研究中所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組菌培養方法

搖瓶種子液培養、搖瓶發酵培養及3 L罐發酵培養方法均參考鄒亮等[18]的研究報告，其中的區別在于搖瓶發酵及3 L罐發酵是在本研究所列的培養基中進行，并且發酵溫度均為33 ℃。

1.2.3 菌體濃度測定方法

菌體濃度是通過測定發酵液在600 nm處的光密度值(OD600)獲得，同時為保證數據的準確性，需要對發酵液進行適當的稀釋使600 nm處的可見分光光度計讀數為0.2～0.8。

1.2.4 酶活性測定方法

α-淀粉酶、蔗糖異構酶及角質酶的酶活性測定方法及單位酶活性定義分別參考李祝等[20]、劉軍彤等[21]以及SU等[22]的研究報告。

1.2.5 RNA樣品的提取及檢測、反轉錄文庫構建及測序

通過RNA提取試劑盒提取發酵菌體的總RNA。通過1%的瓊脂糖核酸電泳分析RNA樣品的完整度和純度；通過NanoDrop 2000分析RNA樣品的濃度及純度；通過Agilent 2100分析RNA樣品的完整度值(RNA integrity number，RIN)。檢測合格后的RNA樣品在干冰的保護下送往武漢華大醫學檢驗所有限公司進行后續的RNA富集純化、反轉錄文庫的構建及測序。

1.2.6 數據分析

測序下機后的Raw Reads通過SOAPnuke軟件和trimmomatic軟件過濾掉包含接頭、低質量以及未知堿基含量高的數據從而獲得Clean Reads。以B.choshinensisHPD31-SP3基因組(GenBank:CP069127)為參考基因組，通過HISAT軟件將獲得的Clean Reads與參考基因組進行比對分析。通過RSEM軟件計算各基因表達水平，并利用FPKM(fragment per kilobases per millionreads)值對不同基因的表達水平進行標準化處理。任意2個樣品間的Pearson系數是利用R軟件計算所得。利用GO數據庫(http://www.geneontology.org/)和KEGG數據庫(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)分別對鑒定到的基因進行GO功能和KEGG功能的分類分析；利用DOOR數據庫(http://161.117.81.224/DOOR3/)、BPROM數據庫(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs & subgroup = gfindb)以及DBTBS數據庫(http://dbtbs.hgc.jp/)分別對目的基因的操縱子結構、啟動子的-35和-10區以及啟動子的σ因子和轉錄因子進行預測。

2 結果與分析

2.1 RNA-Seq樣品的制備

將重組菌BCWPS進行3 L罐發酵培養，提取處于穩定期前期的菌體總RNA作為RNA-Seq測序樣品。另外，為了保證實驗數據的科學有效性，將重組菌BCWPS的3 L罐發酵實驗進行3次生物學重復。如圖1重組菌發酵曲線所示，在3批生物學重復實驗中，重組菌BCWPS均在發酵培養48 h時進入穩定期。因此，提取發酵48 h時的菌體總RNA作為RNA-Seq測序樣品。為了方便后續研究，將由3批生物學重復實驗獲得的樣品分別命名為B_1_T、B_2_T和B_3_T。

空心圖標為OD600，實心圖標為α-淀粉酶活性圖1 重組菌BCWPS的3 L罐發酵曲線Fig.1 The 3 L fermenter fermentation curve of recombinant strain BCWPS

2.2 RNA樣品的質量檢測

質量合格的RNA樣品是獲得有效RNA-Seq數據的重要保障。濃度、純度及完整度是評判RNA樣品質量的3個重要指標。其中評判RNA樣品純度的指標包括OD260/OD280和OD260/OD230，評判RNA樣品完整度的指標主要為RIN。當OD260/OD280值為1.8～2.2，且OD260/OD230值>2.0時則認為RNA樣品具有良好的純度；當RIN越接近10時，RNA樣品的完整度越高。一般情況下，當RIN>8 時即可認為樣品的完整度較好。對于細菌樣品，為保證有足量的RNA(≥1 μg)用于cDNA文庫的構建，RNA樣品的質量濃度應>150 ng/μL。如表2所示，樣品B_1_T、B_2_T和B_3_T對應RNA樣品的OD260/OD280、OD260/OD230及RIN均達標且質量濃度均>1 000 ng/μL，因此均可以用于后續的cDNA建庫分析。

表2 RNA樣品的質量檢測結果Table 2 Quality test results of RNA samples

2.3 RNA-Seq結果的統計分析

2.3.1 測序數據的準確度分析

由表3中的RNA-Seq數據可知，各樣品的Clean Bases均≥3.40 Gb；Clean Reads Q20均>98%；Clean Reads Q30均>91%；Clean Reads Ratio均>97%。由此可知，獲得的轉錄組數據準確度較高，可用于后續分析。

表3 RNA-Seq數據統計表Table 3 Statistical table of RNA-Seq data

2.3.2 測序數據與參考基因組的匹配度分析

由表4中的Clean Reads與B.choshinensisHPD31-SP3基因組(GenBank:CP069127)的比對結果可知，各樣品的Total Mapping值均>80%，Uniquely Mapping值均>75%。由此可知，獲得的Clean Reads與參考基因組的匹配度良好，可進行后續分析。

表4 Clean Reads與參考基因組的比對結果Table 4 Comparison results of Clean Reads and reference genome

2.3.3 測序數據在全基因組水平的轉錄分析

RNA-Seq數據共檢測到5 998個基因，將檢測到的基因分別從GO和KEGG功能分類2個角度做全基因組水平的轉錄分析，分析結果分別如圖2和圖3所示。由圖2可知，RNA-Seq檢測到的基因共分布在34個GO分類條目中，其中基因數量最多的GO分類條目為催化活性(catalytic activity)，占基因總數的41.5%。由圖3可知，RNA-Seq檢測到的基因共分布在25個KEGG分類條目中，其中基因數量最多的KEGG分類條目為全局和總覽圖(global and overview maps)，占基因總數的13.8%。

圖2 基因GO分類分析Fig.2 GO classification analysis of genes

圖3 基因KEGG分類分析Fig.3 KEGG classification analysis of genes

2.3.4 測序樣品的相關性分析

在本研究中，樣品B_1_T、B_2_T和B_3_T間的相關性是通過任意2個樣品間相關性Person系數的平方(R2)進行分析。如圖4所示，任意2個樣品間的R2值均>0.95，因此3個樣品間具有很好的相關性，實驗數據可靠，滿足后續分析的要求。

圖4 樣品相關性熱圖Fig.4 Samples correlation heat map

2.4 高轉錄水平基因的挖掘

目前基于RNA-Seq數據挖掘強啟動子的研究所采用的方法均僅根據FPKM或RPKM值選擇高轉錄水平基因[15-17]。然而，僅基于基因FPKM或RPKM值而不考慮基因功能的高表達基因篩選方法，最終獲得的強啟動子通常難以顯著提高報告蛋白表達水平。因此，在本研究中我們采用了一種高轉錄水平基因新篩選方法，即在基因篩選過程中同時考慮了基因FPKM 值及基因功能。本研究中采用的高轉錄水平基因新方法是基于以下3個原則：(1)根據GO及KEGG功能分類結果，篩選每個GO條目和KEGG條目中FPKM值最高的前3個基因組成初級靶基因文庫；(2)按照圖2和圖3中GO和KEGG分類條目的排列順序，去除初級靶基因文庫中重復的基因，獲得二級靶基因文庫；(3)以胞外培養基中含量最豐富的細胞壁蛋白編碼基因(hwp)的FPKM值為基準，去除二級靶基因文庫中FPKM值低于該基準的基因。若某個GO或KEGG分類條目中所有基因的FPKM均低于該基準，則僅保留該條目中FPKM值最大的基因，最終獲得可用于后續啟動子篩選的終極靶基因文庫。基于上述3個篩選原則，最終獲得了包含19個基因的終極靶基因文庫。為了方便后續研究，將篩選到的基因分別命名為Bsa、Bsb、Bsc、Bsd、Bse、Bsf、Bsg、Bsh、Bsi、Bsj、Bsk、Bsl、Bsm、Bsn、Bso、Bsp、Bsq、Bsr、Bss，對應的FPKM平均值如圖5所示。

圖5 基因的FPKM值Fig.5 FPKM value of genes

2.5 強啟動子的序列分析

基于上述獲得的高轉錄水平基因在基因組中的操縱子結構預測結果，直接選取基因編碼框起始密碼子5′端500 bp內的序列為基因的啟動子序列，然后對啟動子的-35、-10區以及對應的σ因子和轉錄因子進行預測。如表5所示，篩選到的19個啟動子中總共預測到了11種σ因子和32種轉錄因子。

表5 啟動子序列特點Table 5 Promoter sequence characteristics

2.6 強啟動子的篩選及驗證

2.6.1 搖瓶發酵篩選

以α-淀粉酶為報告蛋白構建含有不同啟動子的B.choshinensis重組菌篩選文庫，以含有P2啟動子的重組菌BCWPS為對照，以發酵上清液中的α-淀粉酶活性為篩選指標，進行強啟動子篩選文庫的搖瓶發酵篩選。如圖6所示，不同啟動子介導α-淀粉酶在B.choshinensis中的重組表達水平具有明顯的差異，其中啟動子PE和PF介導的重組菌BCWES和BCWFS的胞外α-淀粉酶活性均高于對照菌BCWPS。重組菌BCWES和BCWFS搖瓶發酵后胞外α-淀粉酶活性分別為7 880.1和4 375.4 U/mL，分別是對照菌BCWPS胞外α-淀粉酶活性(3 367.9 U/mL)的2.3和1.3倍。

圖6 含有不同啟動子的短小芽孢桿菌重組菌的搖瓶培養Fig.6 Shake-flask culture of B.choshinensis recombinant strains with different promoters

2.6.2 啟動子的轉錄活性分析

為了考察啟動子PE、PF和P2的轉錄活性，在本研究中分別測定了重組菌BCWES、BCWFS和BCWPS 在搖瓶發酵24、36和48 h時α-淀粉酶基因的mRNA含量。如圖7所示，啟動子PE、PF和P2具有不同的轉錄活性。其中，啟動子PE和PF的轉錄活性在重組菌搖瓶發酵過程中不斷增強，啟動子P2的轉錄活性在重組菌搖瓶發酵過程中卻先降低后增加。另外，在24和36 h時啟動子PE的轉錄活性均高于啟動子PF和P2，而啟動子P2在48 h的轉錄活性均高于啟動子PE和PF。綜上，啟動子的轉錄活性與重組菌胞外α-淀粉酶活性無明顯的線性關系，這表明除啟動子的轉錄活性外，重組菌胞外α-淀粉酶活性還與其他因素有關，比如基因組中啟動子所對應的目的基因功能及mRNA轉錄后修飾。因啟動子PE介導的重組菌BCWES胞外α-淀粉酶活性最高，因此僅選擇啟動子PE進行后續的研究。

圖7 不同啟動子對mRNA表達量的影響Fig.7 Effects of different promoters on mRNA expression

2.6.3 啟動子PE的通用性分析

為了考察啟動子PE的通用性，在本研究中另外選取蔗糖異構酶和角質酶作為報告蛋白，分別構建由啟動子PE介導的蔗糖異構酶和角質酶B.choshinensis重組菌BCWESI和BCWECUT。將分別由P2啟動子介導的蔗糖異構酶和角質酶重組菌BCWPSI和BCWPCUT與重組菌BCWESI和BCWECUT進行搖瓶發酵48 h后，重組菌BCWPSI和BCWESI胞外上清液中蔗糖異構酶活性分別為29.0和65.9 U/mL，重組菌BCWPCUT和BCWECUT胞外上清液中角質酶活性分別為21.0和26.5 U/mL。其中，重組菌BCWESI胞外蔗糖異構酶活性是重組菌BCWPSI的2.3倍，重組菌BCWECUT胞外角質酶活性是重組菌BCWPCUT的1.3倍。由此可知，啟動子PE較P2所體現的正效果不局限于α-淀粉酶，對提高其他報告蛋白在B.choshinensisHPD31-SP3中的重組表達也具有一定的通用性。

2.6.4 重組菌BCWES的3 L罐發酵驗證

為了進一步驗證啟動子PE的效果，我們將重組菌BCWES進行3 L罐發酵驗證。如圖8所示，當發酵72 h時，發酵液的菌體濃度及胞外上清液中α-淀粉酶活性均達到最大值，分別為23.2和5 626.2 U/mL。而由P2啟動子介導的對照菌BCWPS在3L罐發酵過程中最高的菌體濃度及胞外α-淀粉酶活性分別為13.4和2 358.1 U/mL(圖1)。重組菌BCWES最高的菌體濃度及胞外α-淀粉酶活性分別是重組菌BCWPS的1.7和2.4倍。因此，與重組菌BCWPS相比，盡管菌體濃度的增加有利于提高重組菌BCWES胞外α-淀粉酶活性，但PE作為一種較P2更高效的強啟動子也是重組菌BCWES具有較高胞外α-淀粉酶活性的一個不可忽視的重要原因。綜上，PE啟動子與廣泛應用于B.choshinensis中的強啟動子P2相比是一種更高效的新內源性強啟動子。

圖8 重組菌BCWES的3 L罐發酵曲線Fig.8 The 3 L fermenter fermentation curve of recombinant strain BCWES

3 結論

本研究通過RNA-Seq技術獲得了B.choshinensis的轉錄組數據，并基于基因FPKM值及基因功能，挖掘到了新內源性強啟動子PE和PF。其中，以α-淀粉酶為報告蛋白，啟動子PE介導的重組菌BCWES經搖瓶和3 L罐發酵后的胞外α-淀粉酶活性分別是P2啟動子介導的對照菌BCWPS胞外α-淀粉酶活性的2.3和2.4倍。另外，以蔗糖異構酶和角質酶為新的報告蛋白證明了啟動子PE具有一定的通用性。因此，本研究為B.choshinensis表達系統提供了新的強啟動子，有助于進一步擴大B.choshinensis表達系統的應用范圍。