青海傳統發酵牦牛乳制品中乳酸菌資源發掘及評價

劉莉穎，宋天霖，周藝萍，李選文，熊智*

1(西南林業大學 生命科學學院，云南 昆明，650224)2(青海省婦女兒童醫院，青海 西寧，810000)

牦牛奶與同體積的普通黑白花牛奶比較，含鐵量是其9.8倍，含鋅量是其3倍，含鈣量和氨基酸含量是其1.15倍，蛋白質含量是其1.1倍，乳脂和乳蛋白率也較高，被稱為純天然的“濃縮乳”[1]。游牧民通常將擠出的鮮牦牛奶不經加熱殺菌，直接布袋過濾，置于陶罐中在陰涼處發酵。青海地區特殊的氣候環境(高寒、缺氧)、牦牛奶極高的營養價值及游牧民族傳統的制作工藝賦予了發酵牦牛乳制品特殊的微生物資源[2]。乳酸菌是一類能使可發酵糖類化合物轉化成乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱，廣泛應用于酸奶、奶酪、面包、魚和肉等發酵食品的加工中，賦予它們獨特的風味和質構特點。相當多的乳酸菌是益生菌，能促進動物生長、調節胃腸道正常菌群、維持微生態平衡、提高機體免疫力等[3-4]。對青海傳統發酵牦牛乳制品中乳酸菌資源進行發掘及評價具有現實意義和應用價值。

目前對青海傳統發酵牦牛乳制品中的乳酸菌尚未有較全面的功能及發酵特性評價。我國成年人飲奶后乳糖吸收不良人群可達80%，乳酸菌可自主合成β-半乳糖苷酶，可以降低乳糖含量，緩解人群中普遍存在的乳糖不耐癥[5]。某些乳酸菌會在生長過程中向外部環境中釋放具有抑菌活性的細菌素，細菌素具有無毒、無抗藥性、無副作用、無殘留等優點，已經成為現階段乃至今后很長一段時間微生物天然防腐劑的研究熱點[6]。凝乳時間決定著乳酸菌的凝乳能力，是乳酸菌是否適合作為乳制品發酵劑的一項重要考察指標。

本研究收集整理青海地區傳統發酵牦牛乳制品中的乳酸菌資源，并進行全面評價，分別發掘具有產細菌素能力、產β-半乳糖苷酶能力強、凝乳能力好的乳酸菌，為保護和利用我國傳統乳制品中乳酸菌資源提供基礎數據，為發現新的更安全的食品添加抑菌劑提供素材，為β-半乳糖苷酶的生產和開發具有特色的發酵制品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 牦牛乳制品

本研究所用牦牛乳制品取自青海省海北藏族自治州、海南藏族自治州、黃南藏族自治州、果洛藏族自治州和玉樹藏族自治州牧民家中，共計18份樣品。

1.1.2 菌株

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 19111，美國典型菌種保藏中心；大腸埃希菌(Escherichiacoli)CMCC 44102、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) CMCC 26003、中國醫學微生物菌種保藏管理中心[17]。

1.1.3 培養基

MRS培養基、MRS肉湯，北京陸橋技術股份有限公司；脫脂奶粉，美國BD公司。

1.1.4 主要試劑和儀器

胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、過氧化氫酶、溶菌酶、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(5-brome-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside, X-gal)、2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)、鄰硝基苯酚,Sigma有限公司;API50 CH培養基、API50 CHL培養基,梅里埃技術有限公司。其余試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

Synergy LX酶標儀，美國BioTek公司；IMH180培養箱，美國Thermo Fisher公司；AC2-6S1生物安全柜，Esco科技有限公司；SX-700高壓滅菌鍋，日本TOMY公司；5424R臺式微量高速冷凍離心機, 艾本德中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離及篩選

取10 g牦牛乳制品置于均質袋中，加入100 mL無菌生理鹽水，用均質器拍擊2 min，取1 mL菌懸液，梯度稀釋后分別涂布于質量分數為1%的CaCO3MRS瓊脂平板上，37 ℃靜置培養24～48 h。選出菌落周圍形成透明圈的菌落，連續劃線培養純化。選出革蘭氏染色證實為革蘭氏陽性、H2O2酶實驗為陰性的菌株保存[7-9]。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 梅里埃API50試劑盒生化鑒定

API 50 CHL試劑盒用于乳酸桿菌和相關菌的鑒定，它是由49種可發酵碳水化合物組成的簡易培養基，培養時由于碳水化合物產酸，pH下降，使指示劑變色，顯示結果構成菌株的生化圖譜，得到的生化譜用API WEB系統讀取，得到菌株鑒定結果。操作方法參見梅里埃API50試劑盒使用說明[10]。

1.2.2.2 分子生物學鑒定

提取分離得到菌株的基因組DNA，用細菌16S rRNA 基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3′)擴增菌株的16S rRNA基因。擴增產物經質量分數為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對在 1 500 bp處出現較亮條帶的PCR產物進行測序。測序結果與NCBI數據庫中序列進行比對分析，用MEGA軟件構建進化樹[11]。

1.2.3 產β-半乳糖苷酶能力評價

1.2.3.1 產β-半乳糖苷酶乳酸菌篩選

將X-gal配制成20 g/L的N,N-二甲基酰胺溶液(-20 ℃避光保存)。將純化后的乳酸菌菌株接種至MRS液體培養基進行復壯培養，隨后吸取50 μL菌液涂布于MRS瓊脂培養基上，于37 ℃培養24～48 h，待所接種的菌株生長成單個菌落時，滴加配制的X-gal 溶液至菌落上，37 ℃培養24 h，觀察菌落顏色變化[12-13]。

1.2.3.2 β-半乳糖苷酶活性測定

取1 mL培養液8 000 r/min、4 ℃離心10 min；棄上清液得到菌體沉淀，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入0.2 mL 的質量分數為0.2%的溶菌酶破壁，37 ℃水浴1 h，加0.2 mL 4 mol/L的NaCl混勻，8 000 r/min、4 ℃離心 10 min；取0.25 mL上清液，37 ℃水浴5 min，加入預熱至37 ℃的20 mmol/L ONPG 0.25 mL，37 ℃水浴反應30 min；加入0.75 mL的0.5 mol/L的NaCO3溶液，在420 nm處測定OD值，進而換算成β-半乳糖苷酶活性[14]。ONP的標準曲線方程為y=1.885 3x+0.001 6，R2=0.998 1。β-半乳糖苷酶活性單位定義為：1 mL酶液在37 ℃，pH 6.8的條件下，1 min水解ONPG所產生1 μmol ONP的酶量為1個酶活性單位，以U/mL表示[15]。

1.2.4 抑菌能力評價及產細菌素乳酸菌篩選

1.2.4.1 抑菌能力評價

將乳酸菌菌株以體積分數1%的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清液，用1 mol/L NaOH調pH值為6.0[16]。選取食品中常見致病菌單核細胞增生李斯特氏菌(ATCC 19111)、大腸埃希菌(CMCC 44103)、金黃色葡萄球菌(CMCC 26003)[17]為指示菌。先將6 mL MRS固體培養基平鋪于雙碟中，置于水平臺面上靜置凝固作為底層，另取MRS固體培養基適量加熱融化后，放冷至48～50 ℃，分別加入稀釋至約108CFU/mL的新鮮培養的指示菌適量，搖勻，在每個雙碟中分別加入10 mL，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置在水平臺上冷卻后，將牛津杯輕輕放置于平板上，將離心上清液加入牛津杯后于4 ℃冰箱中擴散5 h，37 ℃ 培養24 h，測量抑菌圈大小[18-19]。

1.2.4.2 產細菌素乳酸菌篩選

選取對3種指示菌均具有明顯抑制作用的乳酸菌，分別用過氧化氫酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K在各自作用的最適pH值下處理發酵上清液，各酶的最終質量濃度為1 g/L，37 ℃水浴2 h后，再調回pH值6.0，比較抑菌圈變化[20]。

1.2.5 凝乳能力評價

將乳酸菌菌株以體積分數1%的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h后，稀釋至約108CFU/mL。取108CFU/ml的菌懸液，以體積分數2%的接種量接種于10 mL脫脂乳中，記錄凝乳時間[21]。

1.3 數據處理

使用SPSS 26.0軟件對數據進行相關性分析，所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 牦牛乳制品中乳酸菌的分離

采用選擇性分離方法從牦牛乳制品中共分離培養出32株菌株。根據菌落形態特征，選取22株菌落呈黃白或白色，圓形微隆起，表面光滑，顯微鏡鏡檢下革蘭氏陽性，無芽孢，長桿狀、短桿狀或球狀，H2O2酶試驗陰性的菌株進行保存(表1)。

表1 牦牛乳制品中乳酸菌分離情況統計Table 1 Statistics on the isolation of lactic acid bacteria from yak dairy products

2.2 梅里埃API50試劑盒生化鑒定

使用法國梅里埃公司的API50 CHL試劑盒對選取的22株菌株進行鑒定。所得生化譜用API WEB系統讀取，結果見表2。

表2 梅里埃API50試劑盒生化鑒定結果Table 2 Results of biochemical identification using the API50 kit

Y1-1、Y2-1、Y3-1、Y4-1、Y5-1、Y5-2、Y6-1、Y7-1、Y8-1、Y10-1、Y11-1、Y12-1、Y12-2、Y16-2、Y18-2鑒定為嗜熱鏈球菌，Y7-2、Y13-2、Y15-1鑒定為發酵乳桿菌 1，Y9-1鑒定為植物乳桿菌2，Y9-3鑒定為乳明串珠菌，Y13-1鑒定為乳酸乳球菌乳亞種2，Y14-1鑒定為卷曲乳桿菌。

2.3 菌株的分子生物學鑒定

選擇枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株的相關基因作為外參，以16S rRNA基因的部分序列構建系統發育樹(圖1)。通過比對菌株的16S rRNA基因序列，確定這22株乳酸菌菌株分別是Streptococcusthermophilus(嗜熱鏈球菌15株)，Lactobacillusfermentum(發酵乳桿菌3株)，Enterococcusdurans(堅忍腸球菌1株)，Leuconostoclactis(乳明串珠菌1株)，Enterococcusfaecium(糞腸球菌1株)，Streptococcusmacedonicus(馬其頓鏈球菌1株)。

圖1 基于16S rRNA基因分析的部分分離菌株和近源菌株的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic trees based on 16S rRNA gene sequencing results of partial isolates and related strains

對比16S rRNA分子生物學鑒定結果和梅里埃API50試劑盒生化鑒定結果，22株菌株中，19株(86.4%)菌株的鑒定結果完全相同，3株(13.6%)菌株的鑒定結果不同，分別是Y9-1，Y13-1和Y14-1,如表3所示。

表3 菌株鑒定結果匯總Table 3 The results of strain identification

2.4 產β-半乳糖苷酶能力評價

β-半乳糖苷酶催化無色的X-gal水解呈藍色，實驗測得滴加X-gal溶液后菌株Y9-1、Y9-3、Y13-1呈淡藍色，Y14-1不變色，其余菌株呈藍色。

β-半乳糖苷酶活性測定結果見圖2，不同乳酸菌具有不同的β-半乳糖苷酶活性，即使是同屬不同種，甚至不同亞種的乳酸菌，其β-半乳糖苷酶活性也有所不同。酶活性測定結果與X-gal水解實驗結果相印證。結合菌株鑒定結果，嗜熱鏈球菌、發酵乳桿菌普遍具有較好的β-半乳糖苷酶活性。堅忍腸球菌、乳明串珠菌、糞腸球菌和馬其頓鏈球菌幾乎不具有產β-半乳糖苷酶能力。

圖2 β-半乳糖苷酶活性測定結果Fig.2 The results of β-galactosidase activity

2.5 抑菌能力評價

采用管碟法，測得Y9-1對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和單核細胞增生李斯特氏菌均有抑制作用，抑菌圈直徑分別為16.30、28.40、22.93 mm，結果見圖3。Y13-1對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和單核細胞增生李斯特氏菌均有抑制作用，抑菌圈直徑分別為18.87、25.65、12.30 mm，結果見圖4。其余菌株均未表現出對指示菌的抑制能力。結合菌株鑒定結果，嗜熱鏈球菌和發酵乳桿菌普遍不具有抑菌能力，堅忍腸球菌Y9-1和糞腸球菌Y13-1具有較強的抑菌能力。

菌株Y9-1、Y13-1的發酵上清液用H2O2酶處理后，抑菌圈大小和未作處理的上清液抑菌圈大小基本一致，用胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌圈完全消失。表明上清液中的抑菌物質不是H2O2，而是細菌素。

a-對金黃色葡萄球菌的抑制能力；b-對大腸埃希菌的抑制能力；c-對單核細胞增生李斯特氏菌的抑制能力圖3 Y9-1對指示菌的抑菌能力Fig.3 The bacteriostatic ability of strain Y9-1 to indicator bacteria

a-對金黃色葡萄球菌的抑制能力；b-對大腸埃希菌的抑制能力；c-對單核細胞增生李斯特氏菌的抑制能力圖4 Y13-1對指示菌的抑菌能力Fig.4 The bacteriostatic ability of strain Y13-1 to indicator bacteria

2.6 凝乳能力評價

測定各菌株的凝乳時間，菌株Y7-2、Y9-3、Y13-2、Y15-1不具有凝乳能力，其余菌株凝乳時間見圖5，Y9-1凝乳時間較長達37 h。其余菌株凝乳時間均在8～19 h。結合菌株鑒定結果，發酵乳桿菌和乳明串珠菌不具有凝乳能力。嗜熱鏈球菌、糞腸球菌和馬其頓鏈球菌凝乳時間均<20 h，凝乳能力強。堅忍腸球菌Y9-1凝乳時間長，凝乳能力弱。

圖5 18株乳酸菌的凝乳時間Fig.5 Coagulation time of 18 lactic acid bacteria

3 結論與討論

現在大多數文獻中菌株鑒定采用基因鑒定的方法，忽視了表型鑒定。表型鑒定和基因鑒定屬于2個不同方法，對應2種不同的分類學，基因決定蛋白，進而決定表型，兩者互為補充。本研究同時采用梅里埃API50試劑盒和16S rRNA分子生物學方法鑒定分離株，19株(86.4%)菌株的鑒定結果完全相同，3株(13.6%)菌株的鑒定結果不同。采用不同的鑒定方法得到不同的鑒定結果是菌株鑒定中時常碰到的[22-23]，凡是試驗方法均有一定的誤差，為了得到更準確的結果，有必要結合多種鑒定方法。

本研究從青海傳統發酵牦牛乳制品中分離得到22株菌株，其中嗜熱鏈球菌15株(68.2%)，發酵乳桿菌3株(13.6%)，堅忍腸球菌1株(4.5%)，乳明串珠菌1株(4.5%)，糞腸球菌1株(4.5%)，馬其頓鏈球菌1株(4.5%)。青海省全省大部分地區海拔在3 000～5 000 m，氣溫低，晝夜溫差大，含氧量隨海拔升高而降低。不同采樣地的海拔和氣候不同，適合生長的菌株不同。

本研究分離得到的15株嗜熱鏈球菌和3株發酵乳桿菌均具有較好的β-半乳糖苷酶活性。而堅忍腸球菌、乳明串珠菌、糞腸球菌和馬其頓鏈球菌幾乎不具有產β-半乳糖苷酶能力，與IBRAHIM等[24]發現嗜熱鏈球菌ST3(StreptococcusthermophillusST3)具有很好的 β-半乳糖苷酶活性的研究結果相一致。β-半乳糖苷酶可以將乳糖轉化為葡萄糖和半乳糖，降低乳糖含量，避免乳糖結晶析出，增加乳品甜度，緩解人群中普遍存在的乳糖不耐癥[5]。目前不同來源的β-半乳糖苷酶已被應用于低乳糖牛奶的生產當中，乳糖的水解可以增加乳制品的甜度，從而使其適合乳糖不耐癥人群的消費[13]。雖然可分泌半乳糖苷酶的生物種類繁多，但目前主要采用微生物發酵的方法來生產β-半乳糖苷酶，主要是因為微生物具有生命力強、繁殖速度快、不受季節影響、無污染及易于分離等優勢。因此選育微生物菌種仍是生產β-半乳糖苷酶的主要方式[14]。本研究為β-半乳糖苷酶的生產提供了科學依據。

本研究發現了2株產細菌素的乳酸菌Y9-1和Y13-1，所產細菌素對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、單核細胞增生李斯特氏菌均有較強抑制作用，具有廣譜抑菌活性。細菌素是由某些細菌在發酵過程中通過核糖體合成產生的一類有抑(殺) 菌活性的蛋白或多肽類物質[25-27]。其作用機制特殊，致病菌不會對其產生耐藥性，也不會像抗生素一樣產生耐藥株，由于其本質是多肽，在人體內會被蛋白酶消化，因而不會改變人體腸道正常菌群的存活，已經成為現階段乃至今后很長一段時間微生物天然防腐劑的研究熱點[28]，本研究為研究者今后進一步研究這2種細菌素的分子結構、抑菌機制等奠定了基礎，為發現新的更安全的食品添加抑菌劑提供了素材。

本研究分離得到的嗜熱鏈球菌、糞腸球菌和馬其頓鏈球菌凝乳能力強，堅忍腸球菌凝乳能力弱，發酵乳桿菌和乳明串珠菌不具有凝乳能力。凝乳時間是指牛乳經乳酸菌發酵凝結呈果凍狀且傾斜無液態流動時所需的時間，凝乳時間決定著乳酸菌的凝乳能力[21]，凝乳能力是乳酸菌是否適合作為乳制品發酵劑的一項重要考察指標，本研究為開發具有特色的發酵制品提供了理論依據。