金雀異黃酮對叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的衰老H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用

劉亞輝，劉思彤，王萱，楊蕊，金明*

1(延邊大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉，133002)2(北京市心肺血管疾病研究所，北京，100029)

衰老是指隨年齡增長，細(xì)胞衰老累及組織及器官，致使衰老相關(guān)疾病發(fā)生的過程[1]。目前，隨著人類平均壽命的增長，心血管疾病正在成為西方國家的第一大死因，在中國人群中也廣泛存在[2-3]。衰老增加了罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，其本身也被認(rèn)為是發(fā)展為心臟病的主要決定要素，其中心肌細(xì)胞衰老是引起心血管疾病的重要原因之一[4-5]。因此，延緩心肌細(xì)胞衰老對改善心血管疾病至關(guān)重要。

大豆是一種人類和動(dòng)物優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的主要來源，其具有高蛋白、無膽固醇的特點(diǎn)[6]。大豆中含有多種活性成分，包括異黃酮、多肽、維生素E等。金雀異黃酮(genistein, Gen)，又名染料木素或染料木黃酮，是大豆異黃酮中的主要有效成分，約占大豆中異黃酮總量的60%[7-8]。此外，Gen亦分布于綠豆等蝶形花亞科的豆科植物中[9]。有研究表明，Gen具有抗腫瘤、類雌激素、降血壓和抗脂質(zhì)氧化等多種功能，但對其抗衰老作用研究較少[10-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide, TBHP)誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞，構(gòu)建衰老模型，觀察Gen對衰老H9c2細(xì)胞的影響，為Gen在臨床中防治心肌細(xì)胞衰老引起的心血管疾病的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株，博士德生物工程有限公司；Gen，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TBHP，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-2)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT]，上海源葉生物科技有限公司；DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)培養(yǎng)液、胰酶，美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，美國Gemini 公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)檢測試劑盒、過氧化氫酶(catalase, CAT)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒、總谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal)檢測試劑盒，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，中國Solarbio公司；細(xì)胞磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)抗體、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)抗體、p-AKT抗體、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulatory protein kinase1/2, ERK1/2)抗體、p-ERK1/2抗體、P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase, P38)抗體、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-related protein-1, Keap1)抗體，美國Santa Cruz公司；P53抗體、核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2)抗體、血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1, HO-1)抗體、p-PI3K抗體，美國Abcam公司；P21抗體、p-P38抗體、c-Jun 氨基端激酶(c-jun amino-terminal kinase, JNK)抗體、p-JNK抗體、β-actin抗體，美國Cell Signaling公司；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗，納川科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RT-2100酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱，美國Bio-Tek公司；低溫高速離心機(jī)，美國科俊電器公司；垂直板電泳儀、迷你轉(zhuǎn)印電泳儀，北京六一生物科技有限公司；UVP 凝膠成像儀，美國UVP公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥品配制

Gen溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制成100 mmol/L原液，-20 ℃保存。實(shí)驗(yàn)中以培養(yǎng)液作為稀釋液，制備到相應(yīng)濃度(DMSO終體積分?jǐn)?shù)<0.1%)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

H9c2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)液(含有10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液)中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每2～3 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代或凍存。

1.3.3 MTT實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)期生長的H9c2細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL接種于96孔板中培育, 分為空白組、對照組、模型組和Gen低、中、高劑量組(0.04、0.2、1 μmol/L)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL(Gen劑量根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定)。細(xì)胞培育24 h后，空白組、對照組和模型組更換培養(yǎng)液，Gen組分別加入終濃度為0.04、0.2、1 μmol/L Gen的培養(yǎng)液孵育24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍。除空白組和對照組換成無血清培養(yǎng)液外，其余各組均加入含200 μmol/L TBHP的無血清培養(yǎng)液，作用2 h，所有組別換成培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按每孔10 μL加入MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育。4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩5～10 min，于492 nm處測定OD值，按公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率：

(1)

式中：A2表示用藥組OD值；A1表示對照組OD值；A0表示空白組OD值

1.3.4 SA-β-gal染色

將細(xì)胞隨機(jī)分成對照組、模型組以及Gen低、中、高劑量組。以密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，各組細(xì)胞處理同方法1.3.3。按照SA-β-gal染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選 3個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)，藍(lán)染細(xì)胞為SA-β-gal陽性細(xì)胞, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按公式(2)計(jì)算SA-β-gal染色陽性率：

(2)

1.3.5 比色法檢測生化指標(biāo)

將細(xì)胞按方法1.3.4進(jìn)行分組及處理后，按照各試劑盒說明書檢測細(xì)胞內(nèi)T-AOC的水平和SOD、GSH-Px、CAT的活性及MDA含量。

1.3.6 western blotting實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞分組及處理同方法1.3.4，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入裂解液V(高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液)∶V(PMSF)=100∶1，在冰上裂解30 min，將細(xì)胞收集于EP管中，勻漿器充分裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清液為細(xì)胞全蛋白。BCA法對蛋白樣品進(jìn)行定量。按每孔30 μg的蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，隨后相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。次日二抗室溫孵育1 h，用ECL顯色液顯色，UVP凝膠成像分析儀中采集條帶圖片，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 Gen對H9c2細(xì)胞存活率的影響

如表1所示，與對照組相比，模型組H9c2的細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，Gen低、中、高劑量組H9c2細(xì)胞的存活率分別提高7.44%、15.28%和26.55%，提示Gen對H9c2細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

表1 Gen對H9c2細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effects of Gen on H9c2 cell viability

2.2 Gen對H9c2細(xì)胞SA-β-gal陽性率的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組H9c2細(xì)胞SA-β-gal陽性率顯著增加(P<0.01)，與模型組比較，Gen組H9c2細(xì)胞SA-β-gal陽性率分別下降36.09%、54.68%和58.33%(P<0.01)，提示Gen可以抑制H9c2細(xì)胞因TBHP刺激而引起的衰老。

a-對照組；b-模型組；c-Gen低劑量組；d-Gen中劑量組；e-Gen高劑量組；f-SA-β-gal陽性率圖1 Gen對H9c2細(xì)胞SA-β-gal陽性率的影響(200×)Fig.1 Effect of Gen on the positive staining of SA-β-Gal in H9c2 cells (200×)注：與對照組比較，*表示P<0.05,**表示P<0.01；與模型組比較，#表示P<0.05,##表示P<0.01；與Gen低劑量組比較，Δ表示P<0.05(下同)

2.3 Gen對H9c2細(xì)胞內(nèi)T-AOC水平，SOD、GSH-Px和CAT活性及MDA含量的影響

如表2所示，與對照組相比，模型組H9c2細(xì)胞內(nèi)T-AOC水平、SOD、GSH-Px、CAT的活性明顯降低(P<0.01)，MDA的含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，Gen低、中、高劑量組H9c2細(xì)胞內(nèi)的T-AOC水平分別升高60.96%、283.77%和378.51%(P<0.05)，SOD活性分別升高35.55%、58.01%和112.91%(P<0.01)，GSH-Px活性分別升高30.00%、76.00%和111.01%(P<0.05)，CAT活性分別升高95.61%、156.58%和207.97%(P<0.01)，MDA含量降低15.13%、41.72%和72.06%(P<0.01)。以上數(shù)據(jù)提示Gen可以提高H9c2細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力，抑制TBHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

表2 Gen對H9c2細(xì)胞內(nèi)T-AOC水平，SOD、GSH-Px和CAT活性及MDA含量的影響Table 2 Effects of Gen on T-AOC， SOD, GSH-Px and CAT activities and MDA content in H9c2 cells

2.4 Gen對H9c2細(xì)胞內(nèi)Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與對照組相比，模型組H9c2細(xì)胞內(nèi)Keap1的蛋白表達(dá)水平明顯升高，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，Gen低、中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)Keap1蛋白表達(dá)水平分別降低13.01%、47.95%和44.18%(P<0.01)，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平分別升高61.65%、93.76%、124.55%和12.57%、54.46%、100.51%(P<0.01)，與MTT實(shí)驗(yàn)及SA-β-gal染色結(jié)果相吻合，提示Gen可以誘導(dǎo)Keap1/Nrf2信號(hào)通路的激活。

圖2 Gen對H9c2細(xì)胞內(nèi)Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Gen on Keap1, Nrf2 and HO-1 protein expressions in H9c2 cells

2.5 Gen對H9c2細(xì)胞內(nèi)P53、P21蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)P53、P21蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，Gen低、中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)P53、P21蛋白表達(dá)水平分別降低40.09%、32.09%、34.71%和57.72%、59.79%、73.28%(P<0.01)。表明Gen的延緩衰老作用可能與其抑制P53、P21蛋白表達(dá)有關(guān)。

圖3 Gen對H9c2細(xì)胞內(nèi)P53、P21蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Gen on the expressions of P53 and P21 proteins in H9c2 cells

2.6 Gen對H9c2細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)PI3K與AKT蛋白磷酸化表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，與模型組相比，Gen低、中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)PI3K與AKT蛋白磷酸化水平分別升高8.17%、29.74%、34.03%和60.89%、111.26%、123.89%(P<0.05)，提示Gen可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路。

圖4 Gen對H9c2細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Gen on the expressions of PI3K/AKT signaling pathway key proteins in H9c2 cells

2.7 Gen對H9c2細(xì)胞內(nèi)MAPKs信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)ERK1/2、P38及JNK蛋白磷酸化表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，與模型組相比，Gen低、中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)ERK1/2蛋白磷酸化水平分別降低17.69%、27.67%和59.30%(P<0.01)，P38蛋白磷酸化水平分別降低19.14%、36.28%和49.75%(P<0.01)，JNK蛋白磷酸化水平分別降低22.47%、27.70%和86.38%(P<0.01)，提示Gen可以抑制MAPKs信號(hào)通路。

圖5 Gen對H9c2細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Gen on the expressions of MAPKs signaling pathway key proteins in H9c2 cells

3 討論與結(jié)論

TBHP是一種可在多種細(xì)胞系中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及細(xì)胞損傷的氧化劑，通過脂質(zhì)過氧化、谷胱甘肽耗竭等發(fā)揮其作用，作用方式與H2O2相類似，但結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，現(xiàn)已被用于構(gòu)建多種細(xì)胞衰老模型[13-15]。細(xì)胞發(fā)生衰老后，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、周期阻滯、衰老相關(guān)蛋白分子的變化等特點(diǎn)，其中SA-β-gal是經(jīng)典的衰老標(biāo)志物之一[16]。可通過檢測SA-β-gal，鑒定細(xì)胞衰老水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TBHP刺激可導(dǎo)致SA-β-gal陽性率顯著升高，而Gen處理后，SA-β-gal陽性率顯著降低，提示Gen可延緩TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞衰老。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)主要在線粒體中產(chǎn)生，而心肌細(xì)胞中線粒體含量較多且抗氧化酶(例如SOD、CAT)水平較低，致使心肌細(xì)胞易受到自由基的損害[17]。氧化應(yīng)激是自由基過多造成的，機(jī)體可以通過調(diào)節(jié)抗氧化劑水平以抵御氧化應(yīng)激，維持氧化劑/抗氧化劑的動(dòng)態(tài)平衡[18-19]。T-AOC可以反映機(jī)體的總抗氧化能力；SOD、GSH-Px、CAT是組成機(jī)體抗氧化劑防御系統(tǒng)的重要抗氧化酶[20]；MDA是最常用的脂質(zhì)過氧化的間接指標(biāo)，反映氧化應(yīng)激水平[21]。為了解Gen對衰老H9c2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的影響，實(shí)驗(yàn)檢測了上述指標(biāo)。結(jié)果表明，Gen可以升高H9c2細(xì)胞內(nèi)T-AOC的水平，SOD、GSH-Px、CAT的活性，降低H9c2細(xì)胞內(nèi)MDA的含量，表明Gen可提高H9c2細(xì)胞的抗氧化能力，進(jìn)而減緩細(xì)胞衰老。

為探究Gen延緩H9c2細(xì)胞衰老的具體作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過western blotting檢測Nrf2、Keap1、HO-1、P53、P21蛋白及PI3K/AKT、MAPKs通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激的傳感器之一，受Keap1負(fù)調(diào)節(jié)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nrf2與Keap1以二聚體形式結(jié)合，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激，Nrf2被釋放并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，促進(jìn)抗氧化基因HO-1等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激[22]。當(dāng)機(jī)體ROS增多，DNA的結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)損傷，腫瘤抑制因子P53可通過激活P21介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和衰老[23]，同時(shí)P21還可與Keap1競爭結(jié)合Nrf2，阻止Nrf2的泛素化和降解[24]。研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/AKT/Nrf2途徑可減弱砷誘導(dǎo)的氧化性腎損傷[25]；抑制MAPKs、激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路可保護(hù)小鼠免受脂多糖/D-半乳糖誘導(dǎo)的急性肝損傷[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)Gen干預(yù)后，Keap1蛋白表達(dá)水平下降，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平上升；P53、P21蛋白表達(dá)水平降低，PI3K、AKT磷酸化蛋白表達(dá)水平升高，ERK1/2、P38、JNK磷酸化蛋白表達(dá)水平降低。此結(jié)果與前人報(bào)道相一致[25-26]。STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)檢索也與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合(圖6)。

圖6 Nrf2與P53、P21蛋白及PI3K/AKT、MAPKs通路關(guān)鍵蛋白相關(guān)性Fig.6 The correlation between Nrf2 and P53, P21 protein, and the key proteins of PI3K/AKT, MAPKs pathways

綜上所述，Gen可延緩H9c2細(xì)胞衰老，可能通過PI3K/AKT、MAPKs信號(hào)通路上調(diào)Nrf2發(fā)揮其抗衰老作用。從類雌激素作用到抗氧化、抗癌能力，越來越多的研究證實(shí)了Gen在不同疾病中的作用，且大豆價(jià)格低廉、獲取便利，使Gen具有更好的發(fā)展前景。隨著研究的不斷深入，Gen在日常保健及疾病防治中發(fā)揮越來越大的作用。