鴨胚源抗氧化肽TD12對HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用

吉正梅，張曉春，彭鈺迪，王樹林*，布麗君,4*，解華東,4

1(青海大學 農牧學院，青海 西寧，810016)2(重慶市畜牧科學院，重慶，402460)3(重慶大學 生物工程學院，重慶，400044)4(重慶市肉質評價與加工工程技術研究中心，重慶，402460)

人體正常代謝會產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，參與細胞的生理和病理過程。然而在一些極端環境下，會產生過量的ROS，當超過細胞的自然抗氧化防御能力時，過高濃度的ROS會破壞氧化還原穩態，導致機體細胞凋亡，特別是自由基不受抑制的產生和長時間積累與癌癥、心血管疾病等慢性疾病密切相關[1]。近年來以蛋白質水解物和多肽形式的天然抗氧化劑因其無毒、高效和環保等特點被廣泛應用于食品與藥物加工中。比如抗氧化肽可以在食品配方中作為預防、延緩氧化應激相關疾病的成分；此外，抗氧化肽還可作為食品添加劑抑制食品的氧化等，對于防止含有油脂的食品氧化性腐敗尤為有用[2-3]。已有許多研究已證明，從植物、動物中發現的多肽可以通過清除自由基，提高細胞內抗氧化酶活性和谷胱甘肽含量水平，進而抑制氧化應激[4]。

鴨胚蛋是健康受精蛋經特殊孵化工藝，使胚胎生長發育且具有生命力的蛋。胚蛋味道鮮美且富有營養，民間早已有食用的習慣，并作為營養、進補的佳品[5]?，F代醫學證明：胚蛋是優質蛋白的重要來源，也是最完善的天然食品之一[6]，其所含的蛋白質、脂類物質、礦物質、維生素、干擾素、溶酶菌、免疫球蛋白等[7-8]與人體代謝和生理調節功能有關。據統計，我國蛋鴨總量占到禽蛋飼養量70%以上[9]，且鴨蛋與雞蛋、鵝蛋等相比有較高含量的蛋白質、必需氨基酸、維生素B1、維生素D3、卵磷脂等[10]。

研究表明，從雞胚蛋中提取的多肽能以完整形式直接吸收進入人血液循環并參與機體的生理功能和代謝調節，具有增強人體免疫力和延緩衰老等顯著功效[11]；以雞胚蛋為原料，制成復合雞胚肽口服液、雞胚營養液及沖劑等也深受消費者喜愛[12-13]。然而通過查閱文獻發現，國內外對鴨胚蛋中多肽進行系統性研究的報道屈指可數。王旭清[14]采用不同工藝參數分離鑒定麻鴨鴨胚蛋和櫻桃谷SM3鴨鴨胚蛋中的多肽，2條多肽均具有良好的起泡性、乳化性及穩定性，且通過動物試驗驗證其良好的耐缺氧性；吳禮萍[7]將鴨胚蛋中多肽與植物多糖進行復合，功能評價研究表明復合物具有較好的抗氧化及抗疲勞功能。本課題組前期研究發現，鴨胚蛋孵育期間抗氧化物質含量呈先上升后下降的趨勢，且第15天時鴨胚蛋酶解物抗氧化活性最強，采用LC-MS/MS數據庫功能注釋、生物信息學預測和熱點基肽等技術，從第15天的鴨胚蛋酶解物中識別到5條具有較強抗氧化功能多肽：VK24、GV17、RK14、LA18和TD12，其中TD12含抗氧化活性的氨基酸比例最高，超過50%[15]。因此本試驗以鴨胚胎源抗氧化肽TD12為研究對象，通過化學方法，體外細胞試驗等方法，驗證鴨胚胎源抗氧化肽TD12對HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用，為鴨胚胎源肽在氧化應激防護方面發揮的作用提供有力證據，以期為鴨胚蛋抗氧化功能性食品的開發提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨胚源肽抗氧化肽TD12(Thr-Val-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Lys-Leu-Trp-Arg-Asp，>98%)，杭州專肽生物技術有限公司制備；人肝癌細胞(HepG2)，上海富衡生物科技有限公司提供；無血清細胞凍存液，上海瑟歐生物科技有限公司；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和0.25%胰酶，美國Gibco公司；Count star細胞計數板、H2O2溶液(分析純)，美國Sigma公司；DPPH自由基清除能力檢測試劑盒、ABTS陽離子自由基清除能力檢測試劑盒、羥自由基清除能力檢測試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)檢測試劑盒、Hoechst 33342 染色劑、DCFH-DA活性氧ROS熒光探針、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)片劑、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)試劑和非變性組織細胞裂解液，北京索萊寶科技有限公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒，浙江如耀生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)和細胞丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒，南京建成生物研究工程所；細胞因子腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ)、人白細胞介素-4(IL-4)、人白細胞介素-8(IL-8)和人白細胞介素-10(IL-10)酶聯免疫檢測試劑盒，碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

371高溫滅菌CO2細胞培養箱、Count star全自動細胞計數儀、EVOS XL細胞成像系統、EVOS FL熒光倒置顯微鏡、BLF-6K 離心機，美國Sigma公司；WSZ-20A旋渦混勻器，上海一恒科學儀器有限公司；ATX224分析天平，日本島津公司；369003臺式低溫離心機，美國Beckman Coulter公司；HVE50自動高壓滅菌器，日本Hirayama公司；U-3900分光光度計，日本株式會社日立高新技術科學；Synergy H1多功能微孔板檢測儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鴨胚源抗氧化肽TD12體外抗氧化能力檢測

鴨胚源抗氧化肽TD12清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基能力均按照試劑盒說明書步驟操作，總抗氧化能力檢測制備FeSO4標準曲線為：Y=21.056X+0.008 6，R2=0.998 4，然后依照標準曲線求得不同濃度TD12的總抗氧化能力。待測樣品為終濃度0.25、0.5、1、2.5、5 μmol/L的TD12溶液，每組待測樣品濃度均設置3個重復。

1.3.2 鴨胚源抗氧化肽TD12對HepG2細胞毒性作用檢測

HepG2細胞培養參考DONATO等[16]的方法，10%(體積分數)FBS混合DMEM高糖培養基，將細胞置于5%(體積分數)CO2細胞培養箱內進行培養。待HepG2細胞貼壁生長，融合成致密單層且細胞覆蓋率達80%以上時，用0.25% 胰蛋白酶溶液消化傳代或進行下一步試驗。

鴨胚源抗氧化肽TD12對HepG2細胞的毒性檢測參照張燕等[17]的方法并略作改進。將5×105cells/mL的HepG2細胞接種于96孔板中(每組設置6個復孔)，設置空白組、對照組和試驗組，空白組加入90 μL培養基，對照組和試驗組加入90 μL細胞懸液，培養24 h細胞貼壁，空白組、對照組分別加入10 μL的培養液，試驗組加入10 μL終濃度為0.2、0.25、0.3、0.5、1、2.5、5 μmol/L和1、5 mmol/L的鴨胚源抗氧化肽TD12溶液，在37 ℃，5% CO2培養箱中孵育24 h后，棄去舊培養液，加入CCK-8[18]工作液，繼續孵育4 h，酶標儀檢測450 nm處OD值。篩選出TD12高、中、低劑量組進行后續試驗。細胞存活率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0表示空白組OD值；AC表示對照組OD值；AS表示試驗組OD值。

1.3.3 H2O2誘導HepG2細胞氧化應激損傷的模型建立

參照XIE等[19]的方法并略作改進，具體操作為：將6×104cells/mL的HepG2細胞接種于96孔板中(每組設置6個復孔)，設置空白組(90 μL培養基)、對照組(90 μL細胞懸液)和試驗組(90 μL細胞懸液)，在37 ℃，5% CO2培養箱中孵育24 h后，空白組和對照組分別加入10 μL培養液，試驗組加入終濃度為100、200、400、600、800 μmol/L的H2O2，繼續孵育 20、40、60、120、240 min 后，采用CCK-8法檢測細胞存活率，HepG2細胞氧化損傷模型選取的最佳損傷濃度為細胞存活率在50%[20]最佳。

1.3.4 鴨胚源抗氧化肽TD12對H2O2誘導損傷的HepG2細胞的保護作用

將密度為 5×104cells/mL 的HepG2細胞接種于96孔板中(每組設置6個復孔)，試驗分為對照組、損傷組和TD12低劑量組，中劑量組及高劑量組，每組加入100 μL細胞混懸液。在37 ℃，5% CO2培養箱中孵育24 h后，對照組和損傷組加入20 μL培養基，TD12低、中、高劑量組分別加入20 μL終濃度0.25、1、5 μmol/L的溶液繼續孵育24 h。然后，對照組加入10 μL培養基，損傷組和保護組分別加入10 μL終濃度為400 μmol/L的 H2O2溶液，繼續孵育1 h后，采用CCK-8法檢測細胞存活率。

1.3.5 Hoechst 33342染色檢測HepG2細胞凋亡

參照SHI等[21]的方法并做改進，將8×105cells/mL的HepG2 細胞接種于6孔板中(每組設置3個復孔)，細胞分為對照組、損傷組、TD12低劑量組、中劑量及高劑量組，按照1.3.4的方法處理，接著各組加入1 mL稀釋好的Hoechst 33342 工作液，在37 ℃，5% CO2培養箱中染色30 min，棄染色液，用PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察各組細胞狀態。

1.3.6 鴨胚源抗氧化肽TD12對H2O2誘導損傷的HepG2細胞內ROS含量的影響

HepG2細胞內ROS含量檢測方法采用DCFH-DA熒光探針法[22]，將密度為 5×104cells/mL的HepG2細胞接種于96孔熒光酶標板中(每組設置6個復孔)，按照1.6方法將細胞分組，培養結束后，棄各孔培養液，并加入10 μmol/L的DCFH-DA溶液，37 ℃ 培養箱中孵育30 min后，棄上清液，用PBS清洗3次，用多功能酶標儀(激發波長485 nm，發射波長525 nm)檢測熒光強度，同時熒光倒置顯微鏡拍照。

1.3.7 鴨胚源抗氧化肽TD12對H2O2誘導損傷的HepG2細胞內抗氧化酶活性的影響

將密度為6×105cells/mL 的HepG2細胞接種于6孔板中(每組設置3個復孔)，按照1.3.4方法將細胞分組，細胞培養結束后，吸取細胞培養液，用于檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量；各孔加入600 μL細胞裂解液，冰上裂解30 min，在4 ℃，1 200 r/min離心10 min，吸取各組細胞懸浮液備用。制作牛血清蛋白標準曲線：Y= 0.000 5X+0.161 3，R2=0.996 2，根據標準曲線及BCA試劑盒操作說明書求得各組細胞蛋白濃度，LDH、MDA、SOD、CAT、GSH-Px含量檢測均嚴格按照試劑盒操作。

1.3.8 鴨胚源抗氧化肽TD12對H2O2誘導損傷的HepG2細胞內細胞因子含量的影響

細胞因子檢測方法參照文獻介紹的ELISA法[23]，將密度為5×105cells/mL 的HepG2細胞接種于6孔板中(每組設置3個復孔)，按照1.3.4方法將細胞分組，細胞培養結束后，按照TNF-ɑ、IL-8、IL-4和IL-10 酶聯免疫試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計與分析

2 結果與分析

2.1 鴨胚源抗氧化肽TD12體外抗氧化能力

鴨胚源抗氧化肽TD12體外抗氧化能力的研究結果見圖1。隨著TD12濃度的增加，其清除DPPH自由基能力有小幅提升，濃度為1 mmol/L的TD12對DPPH自由基清除率最高，為(55.31±3.01)%；清除ABTS陽離子自由基、羥自由基能力和總抗氧化能力均呈濃度依賴性增加，濃度為1 mmol/L時清除ABTS陽離子和羥自由基能力達(92.97±4.40)% 和(98.53±4.08)%，總抗氧化能力為(81.69±1.06)μmol/g。CHI等[24]和MA等[25]的研究證明，從藍鰭金槍魚和蕎麥蛋白質中測定的Gly-Pro-Pro、Gly-Val-Pro-Leu-Thr和Val-Phe-Pro-Trp 肽有較強的清除自由基的能力，其中Trp可產生氫自由基，從而提高肽的抗氧化活性。鴨胚源抗氧化肽TD12中含有較多的疏水氨基酸Trp、Gly、Pro序列，因此從一定程度上對清除自由基更加敏感。

圖1 TD12體外抗氧化能力Fig.1 TD12 in vitro antioxidant capacity

2.2 鴨胚源抗氧化肽TD12對HepG2細胞毒性作用

TD12對HepG2細胞活力的影響研究結果見圖2。如圖2所示，濃度在0.25 μmol/L～5 mmol/L的TD12作用細胞24 h后，各組細胞活力均>95%，與對照組沒有差異(P>0.05)。此結果表明TD12對HepG2細胞無毒性作用。本研究選取0.25 μmol/L低劑量組、1 μmol/L中劑量組、5 μmol/L高劑量組作為鴨胚源抗氧化肽TD12對H2O2誘導細胞氧化損傷的干預劑量進行后續研究。

圖2 不同濃度TD12溶液對HepG2細胞活力影響Fig.2 Effect of TD12 solution of different concentrations on the viability of HepG2 cells

2.3 H2O2誘導HepG2細胞氧化損傷的模型建立

不同濃度H2O2及時間對HepG2細胞存活率的影響見圖3。如圖3所示，隨著H2O2濃度和處理細胞時間增加，細胞存活率降低。100和200 μmol/L的H2O2作用 HepG2細胞40 min后，細胞存活率分別為(89.06±3.40)%、(83.62±1.46)%，細胞存活率與對照組沒有差異(P>0.05)，此時H2O2對細胞沒有致死作用，細胞凋亡率較低，未能達到氧化應激狀態。終濃度為400 μmol/L的H2O2作用60 min 后，細胞存活率下降至(52.65±2.19)%(P<0.01)；而終濃度為600、800 μmol/L的H2O2作用60 min后，細胞存活率僅為對照組的(32.08±2.06)%、(29.41±3.21)%(P<0.01)，120和240 min時細胞存活率明顯降低(P<0.01)，這是由于氧化應激過于嚴重，直接導致細胞損傷死亡導致的結果。故選擇400 μmol/L的H2O2濃度作為誘導HepG2損傷模型的最佳濃度，細胞在此狀態下，既達到損傷的要求，又存有一定活力，符合細胞試驗的要求。

圖3 不同濃度H2O2及時間對HepG2細胞存活率影響Fig.3 Effects of different concentrations of H2O2 and time on the survival rate of HepG2 cells

2.4 Hoechst 33342染色檢測HepG2細胞凋亡

不同濃度H2O2作用HepG2細胞1 h后的染色鏡檢結果見圖4。100與200 μmol/L H2O2處理下，細胞間連接緊密，細胞核大小均一，與對照組相比活細胞數量無明顯減少；400 μmol/L時，細胞核內部分染色質斷裂，此時細胞凋亡增加，有明顯的細胞呈碎塊狀；600、800 μmol/L時，熒光密度較低，氧化應激已過于嚴重，此時熒光微弱，細胞存活率極低，這與2.3中CCK-8檢測結果一致。

a-對照組；b-100 μmol/L H2O2；c-200 μmol/L H2O2；d-400 μmol/L H2O2；e-600 μmol/L H2O2；f-800 μmol/L H2O2(標尺=200 μm)圖4 不同濃度H2O2作用HepG2細胞1 h后Hoechst 33342染色結果Fig.4 Hoechst 33342 staining results of HepG2 cells treated with different concentrations of H2O2 for 1 h

2.5 鴨胚源抗氧化肽TD12對H2O2誘導損傷的HepG2細胞的保護作用

各劑量組TD12對HepG2細胞的保護作用見圖5。由圖5可知，在0.25～5 μmol/L，隨著TD12濃度的增加，細胞相對活力呈濃度依賴性升高。H2O2處理的損傷組細胞存活率為對照組的(52.26±3.14)%；經TD12低劑量組(0.25 μmol/L)預處理細胞后，細胞存活率提升至(59.92±1.35)%，與對照組活率存在差異(P<0.05)；當TD12濃度提高至1 μmol/L和5 μmol/L時，細胞存活率為(81.49±3.22)%和(97.43±2.17)%，均與損傷組細胞存在明顯差異(P<0.01)，在TD12高劑量處理下，細胞存活率幾乎接近對照組。KETANWA等[26]的研究表明：肽鏈的氨基酸組成或空間結構對蛋白質水解物的抗氧化活性有較大的影響，含有Ala、Leu、Pro以及芳香族氨基酸Trp、Phe、Tyr和His的肽鏈能有效增強清除自由基能力。TD12(Thr-Val-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Lys-Leu-Trp-Arg-Asp)中含抗氧化氨基酸比例較高，可見TD12對細胞氧化應激損傷的保護作用與這些氨基酸密切相關，且2.1中證明TD12有較強清除ABTS陽離子自由基與羥自由基能力，在一定程度上能防止羥自由基誘導的DNA損傷，因為非極性氨基酸殘基之間的疏水相互作用能提高抗氧化能力活性[27]。結合2.2細胞毒性試驗結果可以證明：鴨胚源抗氧化肽TD12對細胞的保護作用是通過抑制氧化應激實現的，并不是刺激細胞增殖實現的。

圖5 各劑量組TD12對HepG2細胞的保護作用Fig.5 The protective effect of TD12 in each dose group on HepG2 cells注：與對照組相比，##表示差異顯著(P<0.01)；與損傷組相比，*表示差異顯著(P<0.05),**差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.6 鴨胚源抗氧化肽TD12對H2O2誘導損傷的HepG2細胞內ROS含量的影響

TD12對H2O2誘導損傷的HepG2細胞內ROS含量的影響試驗結果見圖6和圖7，圖6為熒光圖片，圖7為細胞相對熒光強度。DCFH-DA是一種可透過細胞膜的熒光染料，可以定性定量的檢測ROS自由基的動態變化[28]。當400 μmol/L H2O2誘導HepG2細胞發生氧化應激后，增加了胞內ROS積累，大約為對照組的4倍，高水平的ROS可以導致關鍵細胞生物聚合物(如蛋白質、脂質和核酸)破壞損傷的反應，此時能改善氧化應激反應的方法是提供外源性肽來補充細胞抗氧化劑，經過不同劑量組鴨胚源抗氧化肽TD12預處理能顯著抑制H2O2誘導的細胞活力下降，并以劑量依賴性方式減弱H2O2誘導的ROS生成，各組熒光強度也降低(P<0.01)。食源性蛋白質衍生肽是由肽鍵連接的氨基酸組成，如谷胱甘肽，是一種非常強大的天然細胞抗氧化劑，而TD12中一些疏水殘基容易穿過細胞膜，更有效地與ROS相互作用，從而發揮抗氧化作用。這一結果與2.5細胞的保護效應是一致的。

a-對照組；b-400 μmol/L H2O2損傷組；c-0.25 μmol/L TD12+H2O2;d-1 μmol/L TD12+H2O2;e-5 μmol/L TD12+H2O2(標尺=100 μm)圖6 不同濃度TD12處理后HepG2細胞熒光圖像Fig.6 Fluorescence image of HepG2 cells treated with different concentrations of TD12

圖7 各組熒光強度Fig.7 Relative expression of DCFH-DA fluorescence in different groups

2.7 鴨胚源抗氧化肽TD12對H2O2誘導損傷的HepG2細胞內抗氧化酶活性的影響

TD12對HepG2細胞中LDH、MDA、SOD、CAT和GSH-Px抗氧化酶活性的影響試驗結果見表1。LDH對氧化應激有極為敏感，其水平升高可以直接反應氧化損傷的程度。當機體受到氧化刺激時會釋放到細胞培養液中，使得培養液中LDH含量大幅升高，由表1可知，H2O2損傷組的LDH含量比對照組高3.3倍(P<0.01)，隨著TD12濃度增加，細胞培養液中LDH含量明顯降低，這說明TD12預處理可以提高細胞存活率，保護細胞的完整性。MDA是過氧化脂質氧化過程的最終產物之一，MDA可以攻擊細胞膜中不飽和脂肪酸從而引起細胞損傷。由表1可知，H2O2可以提升細胞內MDA含量(P<0.01)，并與TD12濃度呈依賴性關系，TD12高劑量組(5 μmol/L)MDA含量接近對照組，可見TD12能有效抑制細胞內MDA釋放，進而保護細胞膜。

SOD、CAT、GSH-Px是細胞抗氧化防御系統中重要的重要組成部分，可以有效清除體內過量的ROS及羥基誘發的脂質過氧化物，從而保護細胞結構和功能的完整性[29]。由表1可知，細胞經過H2O2處理后，SOD、CAT和GSH-Px的活性與對照組相比均顯著降低(P<0.01)。經過TD12預處理后，3種酶的活性均有所提升且呈濃度依賴性關系，尤其在TD12高劑量組(5 μmol/L)預處理下，細胞內SOD活力為(183.16±2.60) U/mg，CAT活力為(23.83±0.35)U/mg，GSH-Px酶為(46.97±1.71)個活力單位，與損傷組對比均有提升(P<0.01)。

表1 TD12對HepG2細胞中LDH、MDA、SOD、GSH的影響(n=3)Table 1 The effect of TD12 on LDH、MDA、SOD、GSH in H2O2-induced HepG2 cells(n=3)

2.8 鴨胚源抗氧化肽TD12對H2O2誘導損傷的HepG2細胞內細胞因子含量的影響

鴨胚源抗氧化肽TD12對H2O2誘導損傷的HepG2細胞內TNF-ɑ和IL-8、IL-4及IL-10含量的影響見圖8。

a-TNF-α;b-IL-8;c-IL-4;d-IL-10圖8 TD12對HepG2細胞中細胞因子含量的影響Fig.8 The effect of TD12 on the content of cytokines in HepG2 cells

MAPK是一條重要的炎癥信號通路，當機體發生氧化應激時，ROS可刺激激活炎癥信號通路核因子NF-κB，進而誘導多種炎癥因子(TNF-ɑ、IL-8、IL-4等)的表達[30]。由圖8可知，H2O2可顯著提升HepG2細胞中TNF-ɑ和IL-8、IL-4及IL-10含量(P<0.01)，經TD12高劑量預處理(5 μmol/L)細胞后，細胞內TNF-ɑ和IL-8含量幾乎恢復至正常水平，且均濃度依賴性升高；IL-4與IL-10為抗炎因子，當機體受到氧化損傷時，IL-4與IL-10分泌增加，發揮保護機體的作用。TD12低劑量處理組(0.25 μmol/L)細胞內IL-10含量與損傷組相比，反而有所降低。濃度為5 μmol/L的TD12處理細胞后，IL-4含量相比對照組略高，這可能是由于TD12一定程度上可通過上調IL-4分泌增加從而抑制炎癥發生，但具體在通路中相關基因表達，還待進一步研究。炎癥反應與氧化應激密不可分，TNF-ɑ可直接誘導ROS的產生，進一步加重細胞氧化損傷。本試驗結果證明，鴨胚源抗氧化肽TD12均能有效抑制HepG2細胞內TNF-ɑ、IL-8的釋放，維持IL-4、IL-10的穩定，可能減弱炎癥反應和細胞氧化損傷的程度。

3 結論

本試驗研究證明鴨胚源新型抗氧化肽TD12體外清除自由基能力較強，且清除能力與濃度有明顯關系；對H2O2誘導損傷的HepG2細胞表現出較強的預保護作用，可降低由氧化應激產生的ROS、LDH和MDA的含量，一定程度上恢復由H2O2誘導損傷的HepG2細胞中抗氧化酶SOD、CAT與GSH-Px活性；并且有效抑制了由H2O2誘導損傷的HepG2細胞內細胞因子TNF-ɑ、IL-8的釋放及維持IL-4、IL-10的穩定。以上結果顯示，鴨胚源抗氧化肽TD12可能是通過調節細胞中抗氧化酶SOD及GSH-Px等蛋白表達水平起到抑制氧化應激的作用，其相關作用通路有待進一步深入研究。