鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

吉正梅，張曉春，彭鈺迪，王樹(shù)林*，布麗君,4*，解華東,4

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧，810016)2(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶，402460)3(重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶，400044)4(重慶市肉質(zhì)評(píng)價(jià)與加工工程技術(shù)研究中心，重慶，402460)

人體正常代謝會(huì)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，參與細(xì)胞的生理和病理過(guò)程。然而在一些極端環(huán)境下，會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，當(dāng)超過(guò)細(xì)胞的自然抗氧化防御能力時(shí)，過(guò)高濃度的ROS會(huì)破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞凋亡，特別是自由基不受抑制的產(chǎn)生和長(zhǎng)時(shí)間積累與癌癥、心血管疾病等慢性疾病密切相關(guān)[1]。近年來(lái)以蛋白質(zhì)水解物和多肽形式的天然抗氧化劑因其無(wú)毒、高效和環(huán)保等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品與藥物加工中。比如抗氧化肽可以在食品配方中作為預(yù)防、延緩氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的成分；此外，抗氧化肽還可作為食品添加劑抑制食品的氧化等，對(duì)于防止含有油脂的食品氧化性腐敗尤為有用[2-3]。已有許多研究已證明，從植物、動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的多肽可以通過(guò)清除自由基，提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性和谷胱甘肽含量水平，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激[4]。

鴨胚蛋是健康受精蛋經(jīng)特殊孵化工藝，使胚胎生長(zhǎng)發(fā)育且具有生命力的蛋。胚蛋味道鮮美且富有營(yíng)養(yǎng)，民間早已有食用的習(xí)慣，并作為營(yíng)養(yǎng)、進(jìn)補(bǔ)的佳品[5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明：胚蛋是優(yōu)質(zhì)蛋白的重要來(lái)源，也是最完善的天然食品之一[6]，其所含的蛋白質(zhì)、脂類(lèi)物質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、干擾素、溶酶菌、免疫球蛋白等[7-8]與人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能有關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)蛋鴨總量占到禽蛋飼養(yǎng)量70%以上[9]，且鴨蛋與雞蛋、鵝蛋等相比有較高含量的蛋白質(zhì)、必需氨基酸、維生素B1、維生素D3、卵磷脂等[10]。

研究表明，從雞胚蛋中提取的多肽能以完整形式直接吸收進(jìn)入人血液循環(huán)并參與機(jī)體的生理功能和代謝調(diào)節(jié)，具有增強(qiáng)人體免疫力和延緩衰老等顯著功效[11]；以雞胚蛋為原料，制成復(fù)合雞胚肽口服液、雞胚營(yíng)養(yǎng)液及沖劑等也深受消費(fèi)者喜愛(ài)[12-13]。然而通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)鴨胚蛋中多肽進(jìn)行系統(tǒng)性研究的報(bào)道屈指可數(shù)。王旭清[14]采用不同工藝參數(shù)分離鑒定麻鴨鴨胚蛋和櫻桃谷SM3鴨鴨胚蛋中的多肽，2條多肽均具有良好的起泡性、乳化性及穩(wěn)定性，且通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證其良好的耐缺氧性；吳禮萍[7]將鴨胚蛋中多肽與植物多糖進(jìn)行復(fù)合，功能評(píng)價(jià)研究表明復(fù)合物具有較好的抗氧化及抗疲勞功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鴨胚蛋孵育期間抗氧化物質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，且第15天時(shí)鴨胚蛋酶解物抗氧化活性最強(qiáng)，采用LC-MS/MS數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和熱點(diǎn)基肽等技術(shù)，從第15天的鴨胚蛋酶解物中識(shí)別到5條具有較強(qiáng)抗氧化功能多肽：VK24、GV17、RK14、LA18和TD12，其中TD12含抗氧化活性的氨基酸比例最高，超過(guò)50%[15]。因此本試驗(yàn)以鴨胚胎源抗氧化肽TD12為研究對(duì)象，通過(guò)化學(xué)方法，體外細(xì)胞試驗(yàn)等方法，驗(yàn)證鴨胚胎源抗氧化肽TD12對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為鴨胚胎源肽在氧化應(yīng)激防護(hù)方面發(fā)揮的作用提供有力證據(jù)，以期為鴨胚蛋抗氧化功能性食品的開(kāi)發(fā)提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨胚源肽抗氧化肽TD12(Thr-Val-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Lys-Leu-Trp-Arg-Asp，>98%)，杭州專(zhuān)肽生物技術(shù)有限公司制備；人肝癌細(xì)胞(HepG2)，上海富衡生物科技有限公司提供；無(wú)血清細(xì)胞凍存液，上海瑟?dú)W生物科技有限公司；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和0.25%胰酶，美國(guó)Gibco公司；Count star細(xì)胞計(jì)數(shù)板、H2O2溶液(分析純)，美國(guó)Sigma公司；DPPH自由基清除能力檢測(cè)試劑盒、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力檢測(cè)試劑盒、羥自由基清除能力檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)檢測(cè)試劑盒、Hoechst 33342 染色劑、DCFH-DA活性氧ROS熒光探針、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)片劑、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)試劑和非變性組織細(xì)胞裂解液，北京索萊寶科技有限公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，浙江如耀生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和細(xì)胞丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒，南京建成生物研究工程所；細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ)、人白細(xì)胞介素-4(IL-4)、人白細(xì)胞介素-8(IL-8)和人白細(xì)胞介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

371高溫滅菌CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Count star全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、EVOS XL細(xì)胞成像系統(tǒng)、EVOS FL熒光倒置顯微鏡、BLF-6K 離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；WSZ-20A旋渦混勻器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ATX224分析天平，日本島津公司；369003臺(tái)式低溫離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；HVE50自動(dòng)高壓滅菌器，日本Hirayama公司；U-3900分光光度計(jì)，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)科學(xué)；Synergy H1多功能微孔板檢測(cè)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鴨胚源抗氧化肽TD12體外抗氧化能力檢測(cè)

鴨胚源抗氧化肽TD12清除DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基和羥自由基能力均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，總抗氧化能力檢測(cè)制備FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：Y=21.056X+0.008 6，R2=0.998 4，然后依照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得不同濃度TD12的總抗氧化能力。待測(cè)樣品為終濃度0.25、0.5、1、2.5、5 μmol/L的TD12溶液，每組待測(cè)樣品濃度均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)HepG2細(xì)胞毒性作用檢測(cè)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)參考DONATO等[16]的方法，10%(體積分?jǐn)?shù))FBS混合DMEM高糖培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。待HepG2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，融合成致密單層且細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%以上時(shí)，用0.25% 胰蛋白酶溶液消化傳代或進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性檢測(cè)參照張燕等[17]的方法并略作改進(jìn)。將5×105cells/mL的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中(每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔)，設(shè)置空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組，空白組加入90 μL培養(yǎng)基，對(duì)照組和試驗(yàn)組加入90 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁，空白組、對(duì)照組分別加入10 μL的培養(yǎng)液，試驗(yàn)組加入10 μL終濃度為0.2、0.25、0.3、0.5、1、2.5、5 μmol/L和1、5 mmol/L的鴨胚源抗氧化肽TD12溶液，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，加入CCK-8[18]工作液，繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值。篩選出TD12高、中、低劑量組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。細(xì)胞存活率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0表示空白組OD值；AC表示對(duì)照組OD值；AS表示試驗(yàn)組OD值。

1.3.3 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的模型建立

參照XIE等[19]的方法并略作改進(jìn)，具體操作為：將6×104cells/mL的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中(每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔)，設(shè)置空白組(90 μL培養(yǎng)基)、對(duì)照組(90 μL細(xì)胞懸液)和試驗(yàn)組(90 μL細(xì)胞懸液)，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，空白組和對(duì)照組分別加入10 μL培養(yǎng)液，試驗(yàn)組加入終濃度為100、200、400、600、800 μmol/L的H2O2，繼續(xù)孵育 20、40、60、120、240 min 后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，HepG2細(xì)胞氧化損傷模型選取的最佳損傷濃度為細(xì)胞存活率在50%[20]最佳。

1.3.4 鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用

將密度為 5×104cells/mL 的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中(每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔)，試驗(yàn)分為對(duì)照組、損傷組和TD12低劑量組，中劑量組及高劑量組，每組加入100 μL細(xì)胞混懸液。在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，對(duì)照組和損傷組加入20 μL培養(yǎng)基，TD12低、中、高劑量組分別加入20 μL終濃度0.25、1、5 μmol/L的溶液繼續(xù)孵育24 h。然后，對(duì)照組加入10 μL培養(yǎng)基，損傷組和保護(hù)組分別加入10 μL終濃度為400 μmol/L的 H2O2溶液，繼續(xù)孵育1 h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.3.5 Hoechst 33342染色檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡

參照SHI等[21]的方法并做改進(jìn)，將8×105cells/mL的HepG2 細(xì)胞接種于6孔板中(每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)，細(xì)胞分為對(duì)照組、損傷組、TD12低劑量組、中劑量及高劑量組，按照1.3.4的方法處理，接著各組加入1 mL稀釋好的Hoechst 33342 工作液，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中染色30 min，棄染色液，用PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀(guān)察各組細(xì)胞狀態(tài)。

1.3.6 鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)方法采用DCFH-DA熒光探針?lè)╗22]，將密度為 5×104cells/mL的HepG2細(xì)胞接種于96孔熒光酶標(biāo)板中(每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔)，按照1.6方法將細(xì)胞分組，培養(yǎng)結(jié)束后，棄各孔培養(yǎng)液，并加入10 μmol/L的DCFH-DA溶液，37 ℃ 培養(yǎng)箱中孵育30 min后，棄上清液，用PBS清洗3次，用多功能酶標(biāo)儀(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，同時(shí)熒光倒置顯微鏡拍照。

1.3.7 鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響

將密度為6×105cells/mL 的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中(每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)，按照1.3.4方法將細(xì)胞分組，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，用于檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量；各孔加入600 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，在4 ℃，1 200 r/min離心10 min，吸取各組細(xì)胞懸浮液備用。制作牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y= 0.000 5X+0.161 3，R2=0.996 2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及BCA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)求得各組細(xì)胞蛋白濃度，LDH、MDA、SOD、CAT、GSH-Px含量檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒操作。

1.3.8 鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子含量的影響

細(xì)胞因子檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)介紹的ELISA法[23]，將密度為5×105cells/mL 的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中(每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)，按照1.3.4方法將細(xì)胞分組，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，按照TNF-ɑ、IL-8、IL-4和IL-10 酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨胚源抗氧化肽TD12體外抗氧化能力

鴨胚源抗氧化肽TD12體外抗氧化能力的研究結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著TD12濃度的增加，其清除DPPH自由基能力有小幅提升，濃度為1 mmol/L的TD12對(duì)DPPH自由基清除率最高，為(55.31±3.01)%；清除ABTS陽(yáng)離子自由基、羥自由基能力和總抗氧化能力均呈濃度依賴(lài)性增加，濃度為1 mmol/L時(shí)清除ABTS陽(yáng)離子和羥自由基能力達(dá)(92.97±4.40)% 和(98.53±4.08)%，總抗氧化能力為(81.69±1.06)μmol/g。CHI等[24]和MA等[25]的研究證明，從藍(lán)鰭金槍魚(yú)和蕎麥蛋白質(zhì)中測(cè)定的Gly-Pro-Pro、Gly-Val-Pro-Leu-Thr和Val-Phe-Pro-Trp 肽有較強(qiáng)的清除自由基的能力，其中Trp可產(chǎn)生氫自由基，從而提高肽的抗氧化活性。鴨胚源抗氧化肽TD12中含有較多的疏水氨基酸Trp、Gly、Pro序列，因此從一定程度上對(duì)清除自由基更加敏感。

圖1 TD12體外抗氧化能力Fig.1 TD12 in vitro antioxidant capacity

2.2 鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)HepG2細(xì)胞毒性作用

TD12對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響研究結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖2所示，濃度在0.25 μmol/L～5 mmol/L的TD12作用細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞活力均>95%，與對(duì)照組沒(méi)有差異(P>0.05)。此結(jié)果表明TD12對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)毒性作用。本研究選取0.25 μmol/L低劑量組、1 μmol/L中劑量組、5 μmol/L高劑量組作為鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的干預(yù)劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 不同濃度TD12溶液對(duì)HepG2細(xì)胞活力影響Fig.2 Effect of TD12 solution of different concentrations on the viability of HepG2 cells

2.3 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷的模型建立

不同濃度H2O2及時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖3。如圖3所示，隨著H2O2濃度和處理細(xì)胞時(shí)間增加，細(xì)胞存活率降低。100和200 μmol/L的H2O2作用 HepG2細(xì)胞40 min后，細(xì)胞存活率分別為(89.06±3.40)%、(83.62±1.46)%，細(xì)胞存活率與對(duì)照組沒(méi)有差異(P>0.05)，此時(shí)H2O2對(duì)細(xì)胞沒(méi)有致死作用，細(xì)胞凋亡率較低，未能達(dá)到氧化應(yīng)激狀態(tài)。終濃度為400 μmol/L的H2O2作用60 min 后，細(xì)胞存活率下降至(52.65±2.19)%(P<0.01)；而終濃度為600、800 μmol/L的H2O2作用60 min后，細(xì)胞存活率僅為對(duì)照組的(32.08±2.06)%、(29.41±3.21)%(P<0.01)，120和240 min時(shí)細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，這是由于氧化應(yīng)激過(guò)于嚴(yán)重，直接導(dǎo)致細(xì)胞損傷死亡導(dǎo)致的結(jié)果。故選擇400 μmol/L的H2O2濃度作為誘導(dǎo)HepG2損傷模型的最佳濃度，細(xì)胞在此狀態(tài)下，既達(dá)到損傷的要求，又存有一定活力，符合細(xì)胞試驗(yàn)的要求。

圖3 不同濃度H2O2及時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞存活率影響Fig.3 Effects of different concentrations of H2O2 and time on the survival rate of HepG2 cells

2.4 Hoechst 33342染色檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡

不同濃度H2O2作用HepG2細(xì)胞1 h后的染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖4。100與200 μmol/L H2O2處理下，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞核大小均一，與對(duì)照組相比活細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯減少；400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)部分染色質(zhì)斷裂，此時(shí)細(xì)胞凋亡增加，有明顯的細(xì)胞呈碎塊狀；600、800 μmol/L時(shí)，熒光密度較低，氧化應(yīng)激已過(guò)于嚴(yán)重，此時(shí)熒光微弱，細(xì)胞存活率極低，這與2.3中CCK-8檢測(cè)結(jié)果一致。

a-對(duì)照組；b-100 μmol/L H2O2；c-200 μmol/L H2O2；d-400 μmol/L H2O2；e-600 μmol/L H2O2；f-800 μmol/L H2O2(標(biāo)尺=200 μm)圖4 不同濃度H2O2作用HepG2細(xì)胞1 h后Hoechst 33342染色結(jié)果Fig.4 Hoechst 33342 staining results of HepG2 cells treated with different concentrations of H2O2 for 1 h

2.5 鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用

各劑量組TD12對(duì)HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用見(jiàn)圖5。由圖5可知，在0.25～5 μmol/L，隨著TD12濃度的增加，細(xì)胞相對(duì)活力呈濃度依賴(lài)性升高。H2O2處理的損傷組細(xì)胞存活率為對(duì)照組的(52.26±3.14)%；經(jīng)TD12低劑量組(0.25 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞存活率提升至(59.92±1.35)%，與對(duì)照組活率存在差異(P<0.05)；當(dāng)TD12濃度提高至1 μmol/L和5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為(81.49±3.22)%和(97.43±2.17)%，均與損傷組細(xì)胞存在明顯差異(P<0.01)，在TD12高劑量處理下，細(xì)胞存活率幾乎接近對(duì)照組。KETANWA等[26]的研究表明：肽鏈的氨基酸組成或空間結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)水解物的抗氧化活性有較大的影響，含有Ala、Leu、Pro以及芳香族氨基酸Trp、Phe、Tyr和His的肽鏈能有效增強(qiáng)清除自由基能力。TD12(Thr-Val-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Lys-Leu-Trp-Arg-Asp)中含抗氧化氨基酸比例較高，可見(jiàn)TD12對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用與這些氨基酸密切相關(guān)，且2.1中證明TD12有較強(qiáng)清除ABTS陽(yáng)離子自由基與羥自由基能力，在一定程度上能防止羥自由基誘導(dǎo)的DNA損傷，因?yàn)榉菢O性氨基酸殘基之間的疏水相互作用能提高抗氧化能力活性[27]。結(jié)合2.2細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果可以證明：鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的，并不是刺激細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的。

圖5 各劑量組TD12對(duì)HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.5 The protective effect of TD12 in each dose group on HepG2 cells注：與對(duì)照組相比，##表示差異顯著(P<0.01)；與損傷組相比，*表示差異顯著(P<0.05),**差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.6 鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7，圖6為熒光圖片，圖7為細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度。DCFH-DA是一種可透過(guò)細(xì)胞膜的熒光染料，可以定性定量的檢測(cè)ROS自由基的動(dòng)態(tài)變化[28]。當(dāng)400 μmol/L H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激后，增加了胞內(nèi)ROS積累，大約為對(duì)照組的4倍，高水平的ROS可以導(dǎo)致關(guān)鍵細(xì)胞生物聚合物(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸)破壞損傷的反應(yīng)，此時(shí)能改善氧化應(yīng)激反應(yīng)的方法是提供外源性肽來(lái)補(bǔ)充細(xì)胞抗氧化劑，經(jīng)過(guò)不同劑量組鴨胚源抗氧化肽TD12預(yù)處理能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降，并以劑量依賴(lài)性方式減弱H2O2誘導(dǎo)的ROS生成，各組熒光強(qiáng)度也降低(P<0.01)。食源性蛋白質(zhì)衍生肽是由肽鍵連接的氨基酸組成，如谷胱甘肽，是一種非常強(qiáng)大的天然細(xì)胞抗氧化劑，而TD12中一些疏水殘基容易穿過(guò)細(xì)胞膜，更有效地與ROS相互作用，從而發(fā)揮抗氧化作用。這一結(jié)果與2.5細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)是一致的。

a-對(duì)照組；b-400 μmol/L H2O2損傷組；c-0.25 μmol/L TD12+H2O2;d-1 μmol/L TD12+H2O2;e-5 μmol/L TD12+H2O2(標(biāo)尺=100 μm)圖6 不同濃度TD12處理后HepG2細(xì)胞熒光圖像Fig.6 Fluorescence image of HepG2 cells treated with different concentrations of TD12

圖7 各組熒光強(qiáng)度Fig.7 Relative expression of DCFH-DA fluorescence in different groups

2.7 鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響

TD12對(duì)HepG2細(xì)胞中LDH、MDA、SOD、CAT和GSH-Px抗氧化酶活性的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。LDH對(duì)氧化應(yīng)激有極為敏感，其水平升高可以直接反應(yīng)氧化損傷的程度。當(dāng)機(jī)體受到氧化刺激時(shí)會(huì)釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中，使得培養(yǎng)液中LDH含量大幅升高，由表1可知，H2O2損傷組的LDH含量比對(duì)照組高3.3倍(P<0.01)，隨著TD12濃度增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量明顯降低，這說(shuō)明TD12預(yù)處理可以提高細(xì)胞存活率，保護(hù)細(xì)胞的完整性。MDA是過(guò)氧化脂質(zhì)氧化過(guò)程的最終產(chǎn)物之一，MDA可以攻擊細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸從而引起細(xì)胞損傷。由表1可知，H2O2可以提升細(xì)胞內(nèi)MDA含量(P<0.01)，并與TD12濃度呈依賴(lài)性關(guān)系，TD12高劑量組(5 μmol/L)MDA含量接近對(duì)照組，可見(jiàn)TD12能有效抑制細(xì)胞內(nèi)MDA釋放，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜。

SOD、CAT、GSH-Px是細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)中重要的重要組成部分，可以有效清除體內(nèi)過(guò)量的ROS及羥基誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化物，從而保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性[29]。由表1可知，細(xì)胞經(jīng)過(guò)H2O2處理后，SOD、CAT和GSH-Px的活性與對(duì)照組相比均顯著降低(P<0.01)。經(jīng)過(guò)TD12預(yù)處理后，3種酶的活性均有所提升且呈濃度依賴(lài)性關(guān)系，尤其在TD12高劑量組(5 μmol/L)預(yù)處理下，細(xì)胞內(nèi)SOD活力為(183.16±2.60) U/mg，CAT活力為(23.83±0.35)U/mg，GSH-Px酶為(46.97±1.71)個(gè)活力單位，與損傷組對(duì)比均有提升(P<0.01)。

表1 TD12對(duì)HepG2細(xì)胞中LDH、MDA、SOD、GSH的影響(n=3)Table 1 The effect of TD12 on LDH、MDA、SOD、GSH in H2O2-induced HepG2 cells(n=3)

2.8 鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子含量的影響

鴨胚源抗氧化肽TD12對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞內(nèi)TNF-ɑ和IL-8、IL-4及IL-10含量的影響見(jiàn)圖8。

a-TNF-α;b-IL-8;c-IL-4;d-IL-10圖8 TD12對(duì)HepG2細(xì)胞中細(xì)胞因子含量的影響Fig.8 The effect of TD12 on the content of cytokines in HepG2 cells

MAPK是一條重要的炎癥信號(hào)通路，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，ROS可刺激激活炎癥信號(hào)通路核因子NF-κB，進(jìn)而誘導(dǎo)多種炎癥因子(TNF-ɑ、IL-8、IL-4等)的表達(dá)[30]。由圖8可知，H2O2可顯著提升HepG2細(xì)胞中TNF-ɑ和IL-8、IL-4及IL-10含量(P<0.01)，經(jīng)TD12高劑量預(yù)處理(5 μmol/L)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)TNF-ɑ和IL-8含量幾乎恢復(fù)至正常水平，且均濃度依賴(lài)性升高；IL-4與IL-10為抗炎因子，當(dāng)機(jī)體受到氧化損傷時(shí)，IL-4與IL-10分泌增加，發(fā)揮保護(hù)機(jī)體的作用。TD12低劑量處理組(0.25 μmol/L)細(xì)胞內(nèi)IL-10含量與損傷組相比，反而有所降低。濃度為5 μmol/L的TD12處理細(xì)胞后，IL-4含量相比對(duì)照組略高，這可能是由于TD12一定程度上可通過(guò)上調(diào)IL-4分泌增加從而抑制炎癥發(fā)生，但具體在通路中相關(guān)基因表達(dá)，還待進(jìn)一步研究。炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激密不可分，TNF-ɑ可直接誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重細(xì)胞氧化損傷。本試驗(yàn)結(jié)果證明，鴨胚源抗氧化肽TD12均能有效抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)TNF-ɑ、IL-8的釋放，維持IL-4、IL-10的穩(wěn)定，可能減弱炎癥反應(yīng)和細(xì)胞氧化損傷的程度。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究證明鴨胚源新型抗氧化肽TD12體外清除自由基能力較強(qiáng)，且清除能力與濃度有明顯關(guān)系；對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的預(yù)保護(hù)作用，可降低由氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS、LDH和MDA的含量，一定程度上恢復(fù)由H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞中抗氧化酶SOD、CAT與GSH-Px活性；并且有效抑制了由H2O2誘導(dǎo)損傷的HepG2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子TNF-ɑ、IL-8的釋放及維持IL-4、IL-10的穩(wěn)定。以上結(jié)果顯示，鴨胚源抗氧化肽TD12可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中抗氧化酶SOD及GSH-Px等蛋白表達(dá)水平起到抑制氧化應(yīng)激的作用，其相關(guān)作用通路有待進(jìn)一步深入研究。