巨噬細胞極化與脂多糖致新生大鼠支氣管肺發育不良的相關分析研究

甄宏，胡洪玻，榮國杰，黃秀秀，譚嫦，余新圓

（廣西醫大開元埌東醫院 兒科，廣西 南寧 530021）

支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）是早產兒中常見的一種慢性肺部疾病，同時也是引起早產兒死亡并導致其后遺癥的最主要因素［1-3］。BPD 是一種復雜的發病機制，涉及多種病變不成熟的肺，導致肺泡不同程度的簡單化和細支氣管的結構和功能改變［4］。細菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）可引起肺炎癥，導致新生大鼠的高死亡率并且隨后阻滯肺泡的形成，這是BPD 的經典動物模型之一［5-6］。巨噬細胞是單核巨噬細胞系統分化的最終細胞，存在于組織中的巨噬細胞是防御外來入侵的第一道屏障，并在先天免疫中協調白細胞的滲透；其在特異性免疫中作為抗原提呈細胞和重要的炎癥細胞發揮著始動作用［7］。巨噬細胞激活后可發生表型變化，其稱為巨噬細胞極化。

一般來說，經典激活途徑極化的M1 型巨噬細胞具有促炎作用，而替代激活途徑極化的M2 型巨噬細胞具有促進組織修復和再生作用。M1/M2 表型的巨噬細胞常在促炎/抑炎作用間保持平衡［8-9］。本研究通過LPS 作用于新生SD 大鼠建立BPD 動物模型，觀察不同時間點的肺部組織病理變化及巨噬細胞M1/M2 表型的變化，探討BPD 發病與巨噬細胞激活和極化的相關性，為BPD 的輔助治療開辟新途徑。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗開始前購入SD 大鼠23 只。其中，雌性15 只和雄性8 只，12 周齡，每只大鼠體重180～220 g，平均（190.37±5.29）g，均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［許可證號：SCXK（湘）2016-0002］。所有大鼠標準飼養（濕度60%，溫度23～25℃），飼喂自由飲水、日常光照，所有操作遵守動物倫理法。將性成熟的SD 大鼠按照雌雄比2∶1 進行合籠，觀察并記錄雌鼠生產日期，出生幼鼠用于實驗。使用腹腔注射LPS 的方法構造新生大鼠支氣管肺發育不良模型，并在其出生后第1、3、5 天分別注射LPS 劑量為1 mg/kg、1 mg/kg 和2 mg/kg。選取成功造模的27 只作為LPS 組，并選取27 只新生大鼠腹腔在其出生后第1、3、5 天注射等量生理鹽水作為對照組。本研究所納入的54 只4 日齡SD 大鼠，每只體重約為6～10 g，平均（8.37±1.29）g。

1.2 實驗試劑與儀器

細菌脂多糖LPS（美國Sigma 公司），小鼠抗大鼠CD68 抗體、兔抗CD163、FITC 標記山羊抗小鼠IgG（英國Abcam 公司），兔抗大鼠Arg-1 抗體、兔抗大鼠iNOS 抗體（美國Affinity 公司），Cy3 標記山羊抗兔IgG、RNA 提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），流式細胞術抗體CD68-FITC、PE 標記抗兔IgG 抗體（美國Thermofisher 公司），抗CD45 PerCP/Cy5.5、抗CD86-PE（美國Biolegend 公司），熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 株式會社），NovoCyte?流式細胞儀（杭州艾森生物有限公司），CFX Connect?實時熒光PCR 儀（上海伯樂生命醫學產品有限公司）。

1.3 支氣管肺發育不良模型構建及實驗分組

使用腹腔注射LPS 的方法構造新生大鼠支氣管肺發育不良模型，在其出生后第1、3、5 天分別注射LPS 劑量為1 mg/kg、1 mg/kg 和2 mg/kg。利用病理切片蘇木精-伊紅（HE）染色驗證其模型是否成功，染色后顯微鏡下觀察到放射狀肺泡計數較小、呼吸膜厚度增厚、肺纖維化加重則為造模成功［10］。選取成功造模的27 只作為LPS 組，并選取27 只新生大鼠腹腔在其出生后第1、3、5日齡注射等量生理鹽水作為對照組。兩組大鼠分別于10 日齡、14 日齡、21 日齡時各取9 只幼鼠進行觀察：3 只做病理學形態檢查；3 只做流式細胞儀檢查；3 只做PCR 檢查。

1.4 肺部組織病理切片HE 染色

取出鼠肺組織常規石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后進行HE 染色，顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組織化學染色

組織切片經抗原修復后與小鼠抗大鼠CD68 抗體（1∶200）4℃孵育過夜，在室溫靜置45 min。PBS 浸洗玻片后滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（1∶200）37℃孵育30 min，PBS 充分淋洗。DAB 顯色5～10 min，蘇木精復染、返藍、脫水、透明、封片、鏡檢。

1.6 免疫熒光

組織切片水化、抗原修復、通透后予5%BSA封閉30 min。M1 型巨噬細胞染色為小鼠抗大鼠CD68抗體（1∶300）和兔抗大鼠Arg-1抗體（1∶200）。M2 型巨噬細胞染色為小鼠抗大鼠CD68抗體（1∶300）和兔抗大鼠iNOS 抗體（1∶200），4℃孵育過夜。玻片復溫至室溫后，PBS 浸片后滴加FITC 標記山羊抗小鼠IgG（1∶200），Cy3 標記羊抗兔IgG（1∶200），濕盒中37℃孵育30 min。滴加DAPI 避光孵育5 min，對標本進行染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片、鏡檢。

1.7 流式檢測

收集大鼠肺泡灌洗液，用100 μm 濾網過濾去除組織塊，收集濾液1 500 r/min 離心棄上清，PBS洗滌兩遍。加入100 μL PBS 重懸細胞，并平分為A、B 兩管。A 管加入CD68-FITC、CD45 PerCP/Cy5.5、CD86-PE 抗 體；B 管 加 入CD68-FITC、CD45 PerCP/Cy5.5、CD163 抗體，常規孵育染色后。A 管加入500 μL PBS 液重懸細胞混勻后上流式儀檢測；B 管加入PE 熒光標記的抗CD163 二抗，孵育染色、重懸細胞混勻后上流式儀檢測。A管先以CD45 陽性設門、再以CD68 陽性設門，分析CD45/CD68/CD86 三陽性細胞在CD45/CD68 雙陽性細胞中的比例，即為M1 型巨噬細胞占巨噬細胞的比例（M1%）；B 管同樣以CD45 陽性和CD68陽性設門后，分析CD45/CD68/CD163 三陽性細胞在CD45/CD68 雙陽性細胞中的比例，即為M2 型巨噬細胞占巨噬細胞的比例（M2%）。M1% 和M2%的數值相加為極化巨噬細胞占總巨噬細胞的比例（M 極化%）。

1.8 熒光定量PCR 檢測

各組進行RNA 的提取，提取RNA 后根據逆轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA 為模板，在熒光定量PCR 儀上進行檢測。以β-actin 為內參，以對照組的相應基因表達為基數1，2-△△Ct法計算出各組腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α），白細胞介素-10（interleukin-10,IL-10），一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）和精氨酸酶-1（arginase-1,Arg-1）基因mRNA 相對表達量。實驗條件：95℃預變性10min，95℃變性10 s，54.3℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環（見表1）。融解曲線分析：95℃15 s，54.3℃1 min，95℃15 s，54.3℃15 s，54.3℃15 s。

表1 各指標引物序列情況

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件，作圖采用Graphpadprism 8.0 軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較用t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理HE 染色結果

隨著日齡的增長，對照組大鼠肺泡逐漸分化成熟，各時間點的肺泡大小均勻、形態規則，肺泡間隔無增厚，肺泡腔內未見炎性細胞浸潤。隨著日齡的增長，LPS 組大鼠肺泡結構紊亂，肺泡間隔明顯增厚，并伴肺泡腔及肺間隔周圍有炎性細胞浸潤，21 d 時可見明顯的肺泡簡單化。見圖1。

圖1 病理HE 染色（×200）

2.2 免疫組織化學染色CD68 表達結果

染色后CD68 陽性表達呈現胞漿褐色，10 日齡、14 日齡、21 日齡時LPS 組大鼠的CD68 陽性表達細胞數量多于對照組。見圖2。

圖2 免疫組織化學染色肺組織中CD68 表達結果

2.3 免疫熒光染色M1 和M2 型巨噬細胞結果

CD68（FITC 標記呈現綠色熒光）與iNOS（Cy3 標記呈現紅色熒光）M1 型巨噬細胞，CD68與Arg-1（Cy3 標記呈現紅色熒光）標記M2 型巨噬細胞，陽性結果呈現橙色。10 日齡、14 日齡、21 日齡時LPS 組大鼠的M1 型和M2 型巨噬細胞多于對照組，且21 d 時LPS 組M2 型巨噬細胞增加比M1 型更明顯。見圖3。

圖3 免疫熒光染色肺組織中M1 和M2 型巨噬細胞表達結果（×200）

2.4 流式檢測各組各時間點肺泡灌洗液中M1 和M2 型巨噬細胞表達結果

對照組第10、14 和21 天中巨噬細胞極化的比率呈現逐漸增加的趨勢。而LPS 組第10 天已處于較高的極化率值。兩組比較，差異有統計學意義（t=-2.150,P=0.047）。LPS 組第14 天與對照組數值接近（t=-0.803,P=0.434），但在第21 天較對照組稍低，但差異無統計學意義（t=1.811,P=0.089）。M1%∶M2%比值分析結果顯示，對照組第10 天以M1 極化為主，之后演變為M2 極化為主。而LPS 組一直以M2 極化為主，第10 天和第21 天M1%∶M2% 比值均較對照組低，差異有統計學意義（t=4.654 和4.465，均P<0.001）。見圖4。

圖4 流式細胞術檢測肺泡灌洗液中M1 和M2 型巨噬細胞結果

2.5 熒光實時定量PCR 檢測TNF-α、IL-10、iNOS 和Arg-1 表達結果

以對照組基因表達為1，2-△△Ct法計算LPS 組各基因的相對表達量。LPS 組Arg-1 基因相對表達量與對照組有1 倍以上差異：LPS 組第10 天Arg-1 mRNA 表達減少至對照組（0.43±0.21）倍，而在第21 天表達明顯增加至（2.33±0.75）倍。兩組TNF-α、IL-10、iNOS 的mRNA 表達差 異<1 倍。見圖5。

圖5 LPS 組TNF-α、IL-10、NOS 和Arg-1 基因mRNA 相對表達量

3 討論

常用的BPD 造模方法有高氧暴露、機械通氣損傷誘導、宮內炎癥誘導、低氧誘導或復合因素誘導等，由于炎癥被認為是BPD 發生、發展過程中的基石［11］，因此模擬炎癥誘導模型鼠肺泡發育受阻，更符合BPD 的病理生理變化及臨床本質，其是研究BPD 的理想動物模型。肺發育可分為胚胎期、假腺期、微管期、囊狀期和肺泡期等五個階段。容易出現BPD 的早產兒出生時常處于微管期晚期或囊狀期的早期，而在嚙齒動物中，囊狀期則發生在宮內直到出生后5 d。因此采用新生鼠進行BPD 造模，能夠較好地模擬人類早產兒的病理生理狀態［6］。

巨噬細胞M1 極化、M2 極化能夠促使巨噬細胞在炎癥部位聚集、增生和活化，進而分泌大量的炎癥因子，活化的炎癥因子又會對巨噬細胞的釋放起到促進作用，因此炎癥部位聚集大量的炎癥因子，炎癥反應增強［12］。當肺部出現炎癥反應時，大量的炎癥因子和炎癥細胞在肺毛細血管和肺泡腔內聚集，炎癥反應增強，對正常肺組織造成損壞，增加毛細血管的通透性和肺泡的受損程度，最終導致肺部炎癥反應失調、阻礙肺發育，造成支氣管肺發育不良［13］。有體外細胞實驗發現，LPS 可引起巨噬細胞M1 極化，其特征是誘導iNOS 和TNF-ɑ 的產生［14］；或在低LPS 濃度時引起M2 表型極化、高LPS 濃度時引起M1 表型極化［15］。本研究基于動物模型發現LPS 引起肺內巨噬細胞以M2 極化為優勢，這一發現與ZARAMELLA 等［16］在人體中的觀察結果有吻合之處。該研究在發展為BPD 的早產兒肺泡灌洗液中發現了巨噬細胞以M2 極化為優勢。目前被較廣泛接受的觀點認為巨噬細胞M1/M2 極化的平衡影響著器官炎癥/外傷后的結局。其在感染或炎癥之初，巨噬細胞常以M1 極化為主，釋放TNF-α、IL-1b等因子；但如果M1 時相持續，則可能導致組織損傷。因此在M1 應激后繼之以M2 極化為優勢，分泌IL-10 和TGF-b 等來抑制炎癥，有助于促進組織修復、回歸穩態［8-9］。因此本研究結果顯示天時，LPS 組出生后第21 天肺內Arg-1 基因表達明顯上調，分析原因可能與巨噬細胞的M2 極化優勢有關。

由于精氨酸酶（Arg）與一氧化氮合酶（NOS）共用底物L-精氨酸，兩種酶具有競爭關系，而兩者的作用正好相反。NOS 作用產生NO（一氧化氮），促進巨噬細胞向M1 型分化、促進血管舒張。因此除了影響M1/M2 巨噬細胞極化的平衡所致的炎癥和修復外，Arg-1 和NOS 還是一對影響肺血管收縮/舒張和增殖的因子，其比值（平衡）可能對發育中的肺血管網形成產生影響。有研究發現，Arg-1 基因的單核苷酸多態性影響NOS 介導的細胞凋亡，從而可以影響支氣管肺發育不良繼發的肺動脈高壓［17］。本研究發現，LPS 刺激后，新生鼠出生后第21 天Arg-1 mRNA 表達明顯上調，而NOS 表達相對無明顯變化。這樣的Arg-1/NOS 表達失衡可能對肺血管的發生產生影響，進而加速BPD 的病理進展。BPD 特征性的病理生理學改變中，表現除了肺泡簡單化和數量減少外，肺泡血管形成不良［4］，甚至可繼發肺動脈高壓［18］，其已日益為人們所重視。本研究結果還發現，LPS 引起新生大鼠肺中Arg-1 的異常增高表達，可能成為探索BPD 發病機制的重要線索。

綜上所述，LPS 引起新生大鼠的肺損傷在14～21 日齡后發展為支氣管肺發育不良表型，伴隨著巨噬細胞的浸潤增加和M1/M2 型極化，巨噬細胞激活及M1/M2 型極化可通過肺炎癥反應失調而阻礙肺發育。巨噬細胞高表達提示可能存在支氣管肺發育不良，其可用于提前診斷。