超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定小麥中4種真菌毒素

胡 莎，袁 夢，葛文靜，林翠蘋，于業志

（1.青島市糧油質量檢測和軍隊糧油供應中心，山東青島 266000；2.青島市食品藥品檢驗研究院，山東青島 266000；3.青島菲優特檢測有限公司，山東青島 266000）

真菌毒素污染是威脅糧食安全的重要因素，糧食在種植、加工、儲存及流通等環節中可能被真菌毒素污染[1]，最新發布的《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規定了谷物及其制品中對黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFT B1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、赭曲霉毒素A（Orchatoxin A，OTA）及玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）的限量指標[2-3]，這4種真菌毒素是目前為止認為可能對人們的健康構成較大風險的[3-7]。現在國內外對糧油產品中真菌毒素的檢測標準方法一般常見的有膠體金快速檢測法[8-9]、薄層色譜法[10]、酶聯免疫法[11]、高效液相色譜法[12]及液相液質聯用法[13]。

本文旨在建立多功能柱凈化、超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定小麥中DON、OTA、AFT B1和ZEN共4種真菌毒素的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent超高效液相色譜串聯質譜聯用儀（UPLC-QQQ 1290-6460，安捷倫科技有限公司）；離心機（Sartorius sigma 3-18k）振 蕩 器（Heidolph Multi Reax）；電 子 天 平（Sartorius）；MycoSpinTM 400 Multitoxin凈 化 柱（Romer Labs公司）；微型聚四氟乙烯濾膜（0.22 μm）。

超純水（娃哈哈）；乙腈（色譜純）、乙酸（色譜純）、乙酸銨（色譜純）、甲醇（色譜純），德國merck公司；標準溶液DON（100.6 mg/L）、ZEN（100.4 mg/L）、AFT B1（100.3 mg/L）、OTA（100.1 mg/L），Pribolab公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

稱取25 g（精確至0.001 g）樣品于250 mL具塞三角瓶中，加入100 mL乙腈/水（50/50，V/V），放置于震蕩器中混合90 min，靜置1 min后過濾，吸取10 mL濾液于50 mL聚丙烯離心管中，并加入500 μL乙酸混勻，從混合液中移取750 μL至MycoSpinTM 400凈化柱，蓋緊凈化柱振蕩混合1 min，凈化柱底端將凈化柱放入離心管中，轉速10 000 r/min離心30 s，取上清液過0.22 μm濾膜于進樣瓶中，待上機檢測。

1.2.2 溶液的配制

（1）混合標準工作液的配制。將4種真菌毒素標準溶液 依 次 稀 釋 成DON（100 μg/mL）、ZEN（100 μg/mL）、AFT B1（4.0 μg/mL）、OTA（2 μg/mL）的單標儲備液，分別吸取1 500 μL、200 μL、250 μL、1 000 μL的DON、ZEN、OTA、AFT B1單標儲備液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成濃度分別為15.0 μg/mL、2.0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL的混合標準工作液。

（2）標準溶液配制。分別準確移取25 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL和1 000 μL混標溶液于10 mL容量瓶中，用標準曲線溶劑（乙腈-水-乙酸混合液35.0∶64.5∶0.5，體積比）定容至刻度，各標準具體濃度見表1。

表1 標準系列溶液濃度（單位：μg/L）

1.2.3 色譜分離條件

色譜柱C18柱（1.8 μm，100 mm×3.0 mm）；柱溫：35 ℃；進樣體積：4 μL；流動相A：1%乙酸溶液＋5 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B：甲醇，流動相梯度見表2。

表2 液相色譜分離梯度條件

1.2.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；毛細管電壓：4 kV（＋）3.5 kV（－）；干燥氣溫度：350 ℃；霧化氣電壓：40 psi；干燥氣流量：10 L/min；碰撞氣：氮氣；掃描模式：多反應監測MRM；駐留時間：30 ms；

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件的優化

2.1.1 流動相的優化

流動相對檢出目標物質的分離度、響應值、峰型及離子化效率都有影響，根據現有的檢測這4種毒素的檢測標準及相關文獻顯示流動相一般采用甲酸水溶液/乙腈，乙腈/乙酸銨，乙腈/甲酸/甲酸銨，乙腈/水，乙酸銨/甲醇-乙腈，結合需檢出的這4種真菌毒素的結構特性，一般在ESI正負離子模式下[M+H]+、[M-H]-、[M-CH3COO]-、[M+NH4]+離子峰形式出現，本實驗選定流動相為1%乙酸溶液＋5 mmol/L乙酸銨水溶液/甲醇對4種真菌毒素能夠有很好的分離效果。

2.1.2 色譜柱的優化

本實驗比較了兩種色譜柱Eclispse Plus C18（2.1mm×50 mm，1.8 μm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）對4種真菌毒素的分離效果，同樣的色譜條件下后一種色譜柱分離效果更佳。

2.2 質譜條件的優化

2.2.1 母離子的選擇和碎裂電壓的優化

將真菌毒素單標溶液直接連接質譜進樣1 μL，分別在正負離子模式下進行MS2 Scan全掃描，確定各毒素母離子質量數。然后進行MS2 SIM選擇離子監測，優化碎裂電壓。

2.2.2 子離子的選擇和碰撞能量的優化

設置母離子質量數和MS2的掃描范圍，進行Product Ion Scan 子離子掃描，將響應最高的確定為定量離子，次之確定為定性離子，并優化碰撞能量CE。優化完成后進行MRM多反應監測，主要參數見表3。

表3 質譜條件

2.3 線性范圍與檢出限

由表4可知，4種真菌毒素在標準曲線溶液濃度范圍內有較好的線性關系，以3倍和10倍信噪比分別確定目標物的檢出限和定量限。

表4 4種真菌毒素的線性范圍、相關系數、檢出限和定量限

2.4 回收率與精密度

在空白樣品中添加低、中、高3個不同濃度的混合標準溶液，3水平重復測定6次，加標回收率、相對標準偏差結果見表5。3水平加標回收率在86.6%～110.1%，相對標準偏差在3.0%～18.7%，由此可見，方法具有良好的精密度。

表5 4種真菌毒素的加標回收率和精密度

3 結論

本文采用乙腈水提取小麥中4種常見真菌毒素，MycoSpinTM400 Multitoxin 凈化柱凈化，能有效的去除小麥基質中的雜質，減少基質效應，采用三重四極桿液質聯用MRM模式進行檢測，該方法高效快捷、操作簡單、回收率高，精密度與準確度好，適合同時測定小麥中4種真菌毒素。