GC-MS/MS法測定芹菜中毒死蜱殘留量不確定度評定

王金翠

（黑龍江省天潤檢驗檢測研究院有限公司，黑龍江哈爾濱 150009）

近年來，伴隨著農業經濟的高速發展，農藥殘留問題已成為影響人們生活質量的重大問題，農藥施用后殘存于周圍土壤及水體環境中，不僅會毒害藻類、魚類等水生生物，農藥原藥或其在動物體內的代謝物還會通過食物鏈間接進入人體，影響人體健康[1-2]。毒死蜱是一種毒性強、半衰期長，且被廣泛用于芹菜、菠菜等葉菜類蟲害防治的有機磷類殺蟲劑，芹菜中毒死蜱殘留量的食品安全國家標準限量為不得超過0.05 mg/kg，從近些年國家監督抽檢結果中不難發現，芹菜中毒死蜱超量使用問題屢見不鮮，在實際的檢測工作中，樣品檢出結果在國家規定限量值附近是比較常見的問題，此時對檢驗方法的準確度進行更為科學的評價尤為重要[3-5]。自1999年我國首次將測量不確定度評定納入計量技術規范以來，其在檢驗檢測行業的應用逐漸開展，目前，RB/T214—2017、CNAS-CL01：2018等檢測、校準準則中均要求在數據出現臨界值時，需要對檢驗方法進行測量不確定度評定[6-11]。本研究建立的GC-MS/MS法測定芹菜中毒死蜱殘留量的方法，具有較好的選擇性和靈敏度，并可適用于復雜樣品的分析，在建立檢驗方法的基礎上，參考相關規范和指南[12-14]對芹菜中毒死蜱殘留量測定進行不確定度評定，確定影響結果的主要不確定度分量，為檢測數據的可靠性提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GC-MS/MS 7000D氣相色譜三重四級桿串聯質譜聯用儀，美國安捷倫公司；均質器，上海精科；離心機H1850，湖南湘儀；十萬分之一電子天平MS105DU，梅特勒-托利多；AUY120型電子天平，島津菲律賓工廠；移液器（20 μL），Eppendorf。

毒死蜱對照品（純度為99.7%），SITAER；環氧七氯B對照品（濃度為100 μg/mL，溶劑為正己烷），信陽市中檢計量生物科技有限公司；乙腈（色譜純），霍尼韋爾；乙酸乙酯（色譜純），霍尼韋爾；無水硫酸鎂、乙酸鈉，天津博納艾杰爾；凈化管（含1.2 g硫酸鎂、0.4 g PSA），天津博納艾杰爾；氯化鈉（優級純），默克；芹菜為市售品。

1.2 標準溶液的配制

毒死蜱標準溶液。稱取毒死蜱對照品0.010 03 g置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為100 μg/mL的毒死蜱標準溶液。

內標使用液。吸取內標溶液0.50 mL置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為5.00 μg/mL的環氧七氯B內標使用液。

標準系列溶液。吸取毒死蜱標準溶液1 mL置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為1.00 μg/mL的標準溶液，從中分別吸取0.50 mL、1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL和20.00 mL于10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL的標準系列溶液。

基質工作溶液。將空白基質溶液氮氣吹干，加入20 μL內標使用溶液，分別加1 mL的5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL的標準溶液復溶空白基質，即得。

1.3 供試品溶液的制備

取芹菜500 g，攪碎均質后，混合均勻，精密稱取10 g勻漿試樣于50 mL離心管中，精密加入20 mL乙腈，再加入6 g硫酸鎂、1.5 g乙酸鈉、1 g氯化鈉，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min。取上清液10 mL于凈化管（含1.2 g硫酸鎂、0.4 g PSA），渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，精密取5 mL上清液，于40 ℃水浴中氮氣吹至近干。精密加入1 mL乙酸乙酯復溶，加入20 μL內標使用溶液，混勻，過0.22 μm濾膜，待測定。同時進行空白實驗。

1.4 分析條件

氣相色譜條件。色譜柱：VF1701-ms（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；色譜柱溫度：40 ℃保持1 min，以40 ℃/min升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至240 ℃，再以12 ℃/min升溫至300 ℃，保持6 min；氦氣流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：280 ℃；進樣量：1 μL；進樣方式，不分流進樣。

質譜條件。離子源：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：280 ℃：溶劑延遲時間：4 min；掃描方式：多反應監測（MRM）；定性定量離子對見表1。

表1 質譜分析參數

2 結果與分析

2.1 測量模型

式中：X-毒死蜱的含量，mg/kg；c-試樣中毒死蜱的濃度，ng/mL；V-樣液最終定容體積，mL；m-稱取試樣的質量，g；f-試樣稀釋倍數。

2.2 測量不確定度的來源

根據建立的測量模型及樣品的測定過程，芹菜中毒死蜱的不確定度引入來源主要為：①對照品及對照品溶液配制urel（S）；②樣品稱量urel（M）；③樣品前處理過程urel（V）；④校準方法urel（X）；⑤樣品重復性測定urel（rep）；⑥空白樣品加標回收測定urel（R）。

2.3 各標準不確定度分量的評定

2.3.1 毒死蜱對照品及其配制過程引入的相對標準不確定度urel（S）的評定

對照品及對照品溶液配制過程引入的不確定度由對照品自身不確定度，電子天平稱量引入的不確定度，以及標準溶液逐級稀釋過程所用量器引入。

（1）對照品引入的不確定度ur（S1）。由標準物質證書得知，測量所用毒死蜱標準物質的純度為99.7%，擴展不確定度為±2.0%，k=2，按照均勻分布，其相對標準不確定度為：

（2）對照品稱量引入的不確定度ur（S2）。根據《電子天平檢定規程》（JJG 1036—2008）[15]以及方法稱量質量，對照品稱量所用天平（十萬分之一）最大允許誤差為±0.000 005 g，按均勻分布，取包含因子稱取的對照品質量為0.010 03 g。

（3）標準溶液配制引入的不確定度ur（S3）。標準溶液稀釋過程的不確定度主要由所用量器的容量允差以及溫度引起體積變化引入。所用玻璃量器按照《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）[16]檢定，其容量允差均符合A級標準?；|曲線配制過程使用移液器加入內標，按照《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）檢定，所用移液器（規格為20 μL），當量取體積為20 μL時其容量允許誤差為4.0%，容量允差即為20 μL×4.0%=0.000 8 mL。

表2 標準工作溶液稀釋配制引入的不確定度

量器引入的相對標準不確定度ur（S3）：

（4）對照品及對照品溶液配制過程引入的相對標準不確定度urel（S）：

2.3.2 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel（M）的評定

樣品測定過程中共使用天平（萬分之一）稱量2次，根據《電子天平檢定規章》（JJG 1036—2008）以及方法稱量質量，天平最大允許誤差為±0.000 15 g，稱取的樣品質量分別為10.015 1 g、10.007 4 g，按均勻分布，取包含因子

2.3.3 樣品前處理過程帶來的不確定度urel（V）評定

操作過程所用玻璃量具均為A級，評定過程同2.3.1（3），樣品前處理過程所用量器及具體不確定度計算見表3。

表3 樣品前處理過程所用量器引入的不確定度計算表

樣品前處理過程所用量器帶來的不確定度為：

2.3.4 標準工作曲線擬合引入的相對標準不確定度urel（X）

以標準溶液中待測物與內標物濃度比作為橫坐標，標準溶液中待測物峰面積與內標物峰面積比值的平均值作為縱坐標，擬合生成線性回歸方程。

標準工作曲線擬合引入的相對標準不確定度按照公式4計算：

式中：p-試樣連續測定的次數；n-標準溶液測定次數；k-回歸系數；c-試樣平均濃度；c—-標準溶液濃度平均值；ci-標準溶液各個工作液濃度；a-標準曲線斜率。其中，SR為標準曲線殘差的標準差，是曲線擬合過程主要的不確定度來源，SR計算見式5：

式中：Yi-標準溶液各個響應值與內標物響應值比值；a-標準曲線斜率；Xi-標準溶液各點外標與內標物濃度比值；b-截距；n-標準溶液測定次數。

本研究用內標法定量，將標準曲線每個濃度點進樣1次，得到相應峰面積之比，結果見表4。由表4可知，試驗得到標準曲線：Y=12.881 7x+0.148 1，相關系數r=0.999 8，將表4中數據代入式4、式5，得ur（X）=0.020 58，SR=0.233 9，芹菜樣品測定外標與內標濃度之比為1.20，標準工作曲線擬合引入的相對標準不確定度urel（X）=0.017 15。

表4 標準曲線

2.3.5 重復性實驗引入的相對標準不確定度urel（rep）的評定

樣品測量重復性測定引入的不確定度為A類評定，取待測樣品，按樣品制備方法重復進行6次測定，不確定度參照式6計算，測定結果見表5。

表5 重復性測定結果

2.3.6 空白樣品加標回收引入相對標準不確定度urel（R）的評定

在6份空白樣品中均加入濃度為1 μg/mL的毒死蜱標準溶液0.5 mL，按照上述方法測定，毒死蜱的回收率測定結果見表6。

表6 樣品加標回收率

6次回收率測定結果的標準偏差為S=2.139 7%，回收率平均值R=91.47%，空白基質加標回收引入的相對標準不確定度計算結果如式7：

2.4 不確定度的合成

影響芹菜中毒死蜱殘留量測定的各不確定度分量中，對照品及對照品溶液配制不確定度最大，標準曲線擬合次之，具體結果見表7。

表7 檢測過程的相對不確定分量

按照式8合成標準不確定度：

2.5 擴展不確定度U及結果表示

采用GC-MS/MS測定芹菜中毒死蜱殘留量，當樣品中毒死蜱含量為0.048 mg/kg時，其合成標準不確定度=0.048 mg/kg×0.030=0.001 44 mg/kg。根據JJF 1059.1—2012，在95%的置信水平下，取包含因子k=2，擴展不確定度U=0.001 44 mg/kg×2=0.003 mg/kg。因此，毒死蜱殘留量可表示為（0.048±0.003）mg/kg，k=2。

3 結論

本研究通過對GC-MS/MS測定芹菜中毒死蜱殘留量過程中標準溶液的制備、樣品的稱量、樣品前處理過程所使用的移液管及容量瓶等量器、標準工作曲線校準、樣品重復性測定，及空白樣品加標回收測定等不確定度來源進行分析考察，結果表明，標準溶液配制及標準曲線擬合引入不確定度最顯著，方法加標回收率、樣品前處理過程及重復性測試也是不確定度引入的主要來源。因此，可通過增加標準溶液的測定次數，根據樣品選擇合理的線性范圍，增加標準溶液配制過程的移取體積和定容體積以減少標準溶液引入的不確定度，同時也要提高檢測人員試驗水平、試驗回收率以及檢測結果的準確性。