納秒脈沖作用下核孔復合體影響細胞核 膜電穿孔變化的仿真研究

程 顯 陳 碩 呂彥鵬 葛國偉 連昊宇

（1. 鄭州大學電氣工程學院 鄭州 450001 2. 河南省輸配電裝備與電氣絕緣工程研究中心 鄭州 450001）

0 引言

納秒脈沖電場是一種新興的腫瘤物理治療方法。納秒脈沖電場能夠透過細胞膜作用到細胞核、線粒體、內質網、高爾基體等細胞器膜上產生納米級的孔洞，同時會伴隨Annexin-V綁定、Caspase激活、Cytochrome C釋放等凋亡指標出現[1-7]。納秒脈沖電場治療腫瘤時，不需要藥物的參與，且避免了炎癥、潰瘍等副作用。此外，歐道明大學A. G. Pakhomov、A. Rossi等新近發現，納秒脈沖可誘導腫瘤細胞免疫原性死亡，激活機體抗腫瘤免疫應答[8-9]，為納秒脈沖聯合免疫療法治療腫瘤提供了契機。

為更好地研究納秒脈沖電場作用下細胞核膜上的電穿孔效應，麻省理工學院J. C. Weaver等采用網格傳輸模型仿真研究了納秒脈沖電場作用下細胞膜與細胞核膜的電穿孔效應，發現納秒脈沖電場能夠同時作用于細胞膜與細胞核膜上產生電穿孔[10]。米彥采用場-路復合模型仿真分析了細胞內外膜跨膜電位時頻特性，發現納秒脈沖能夠作用于細胞核膜，并使內膜發生穿孔，從而誘導細胞凋亡效應[11]。盧布爾雅那大學D. Miklav?i?等基于有限元數值分析方法，對建立的球形單細胞的多層介電模型研究發現，納秒脈沖作用下細胞核膜的跨膜電壓峰值可大于細胞膜的跨膜電壓，其大小受細胞核膜及內部基質的結構參數和電氣參數影響[12]。

上述文獻表明，納秒脈沖電場作用下細胞核膜是誘導腫瘤細胞凋亡的重要作用靶區，此外，姚陳果團隊新近的實驗與仿真研究發現，由于腫瘤耐藥細胞的核質比較大，相比常規腫瘤細胞，納秒脈沖電場能夠優先殺傷腫瘤耐藥細胞。這為臨床中殺傷耐藥細胞提供了一種新型途徑[13]。而核膜的電穿孔程度與其本身的形態等特性密切相關[4]，然而，已往的仿真研究中僅將細胞核膜簡單等效為完整的形態進行理論分析，但文獻表明，核膜上存在大量的核孔復合體（Nuclear Pore Complexes, NPC），其結構較為復雜，主要結構為胞質環、核質環、輻、中央栓[14-16]，中央栓是位于NPC中心的中空通道，小分子物質可通過擴散作用自由進出，因此，具有高電導率的特性[17-18]。典型單個哺乳細胞核膜上有3 000～4 000個NPC，直徑40～125nm[19]，NPC的存在是否對納秒脈沖電場作用下的細胞核電穿孔效應具有顯著性的影響目前猶未可知，因此，本文建立了考慮細胞核上NPC存在的五層細胞介電模型，分析電穿孔關鍵參數跨膜電壓、孔密度參數的時空變化特性，研究納秒脈沖作用下NPC對細胞電穿孔程度的影響，通過對比無NPC存在下細胞核膜的電穿孔程度，表明NPC的存在會使附近一定區域內的細胞核膜電穿孔狀態發生顯著性的改變，影響區域大小與NPC個數及分布相關。

1 模型建立

選用COMSOL軟件進行仿真計算，模型如圖1所示。求解域由電極、球形細胞組成，其中，電極尺寸為200μm×1μm矩形，電極間距為198μm，考慮NPC作用的細胞介電模型如圖1b所示。為減少網格計算量，提高仿真準確度，細胞膜、核膜設置為接觸阻抗，厚度分別為5nm、40nm[20]。為研究NPC的存在對周圍細胞核膜電穿孔的影響，本文的研究分為兩部分，首先是在無NPC存在下研究細胞核膜上電穿孔的時空分布作為對比；其次在存在NPC狀態下分析細胞核膜上電穿孔的時空分布規律。因電穿孔程度與細胞核膜上的空間位置相關，本文對細胞核膜上的區域進行等距離設置NPC，總數量為8，其介電參數參考電穿孔設定，仿真參數見表1[13]。

圖1 COMSOL仿真計算模型 Fig.1 The simulation model in COMSOL

根據式（1）求解細胞膜、核膜電位Ψ為

式中，ε0為真空介電常數；εr為相對介電常數；σ為電導率；t為時間；?為梯度算子。

細胞膜、核膜接觸阻抗的初始電導率分別為σmem0、σne0，但電穿孔后的磷脂雙分子層通透性提高會導致其等效電導率增大，該部分以σmemt、σnet表示，則考慮穿孔效應的細胞膜電導率定義（核膜與細胞膜計算原理相同，下面以核膜為例進行推導）為

其中

式中，N為電穿孔密度；σP為空隙電導率；rP為穿孔孔半徑；n為孔的相對密度。通過微分方程求解相應變量，有

表1 仿真計算參數 Tab.1 Simulation parameters

式中，ΔΨ(t)為細胞膜內外電位差；rj為時變穿孔半徑；r≥r*；F、R分別為法拉第常數、氣體常數；T為熱力學溫度。式（7）中，第一項為跨膜電位產生的電場力；第二項為磷脂雙分子層親水性頭部空間排斥力；第三項為微孔邊沿線性張力；第四項為細胞膜表明張力，膜的有效張力系數δeff為

式中，δ0為未穿孔細胞膜的單位面積的表面能；δ′為碳水化合物-水交界面的單位面積的表面能；dp為所有穿孔的孔面積之和；d為細胞膜表面積。

為提高仿真結果準確性，選取平行于電場方向的最大截面進行分析[21-23]。其中，施加的方波脈沖寬度為50ns、幅值為300V、上升沿和下降沿各設置為5ns，仿真模擬時間為0～160ns，最大步長為1ns。上述參數方程代入COMSOL軟件的電流模塊和偏微分模塊求解后，進行相關仿真研究。

2 結果與分析

2.1 對細胞膜電穿孔的影響

本文首先分析納秒脈沖電場作用下NPC對細胞膜電穿孔的影響。圖2為θ=0°處（A點）孔密度、跨膜電壓隨時間的變化曲線，圖2a表明納秒脈沖作用期間，孔密度瞬間激增至穩定值；圖2b表明納秒脈沖作用期間，跨膜電壓達到穿孔閾值后迅速降低。 曲線變化高度重合表明NPC的存在不會對細胞膜A點電穿孔產生明顯的影響。

圖2 NPC對A點的孔密度、跨膜電壓的時間特性影響 Fig.2 The effect on the time characteristics of pore density and transmembrane voltage at piont A

圖3為納秒脈沖作用后細胞膜的孔密度、跨膜電壓的空間分布。因其他時刻下的細胞膜孔密度和跨膜電壓隨相位變化曲線所得結果與脈沖電場作用后（t=50ns）的孔密度和跨膜電壓隨相位變化曲線結果基本相同，這里主要展示t=50ns的跨膜電壓和孔 密度變化曲線。從圖中可以看出，NPC的存在也未對細胞膜電穿孔產生明顯的影響，本文重點分析NPC對核膜電穿孔的影響。

圖3 NPC對細胞膜的孔密度、跨膜電壓的 空間特性影響 Fig.3 The effect on the spatial characteristics of pore density and transmembrane voltage on cell membrane

2.2 對核膜電穿孔的影響

本節首先分析距離NPC1 1nm處（見圖1中M點）跨膜電壓、孔密度的時間變化特性。圖4a為NPC對M點跨膜電壓的影響。在無NPC時，M點的跨膜電壓迅速上升至1.09V，脈沖結束后跨膜電壓下降至0.51V。當M點附近存在NPC時，其跨膜電壓的峰值僅為0.64V。脈沖結束后，跨膜電壓下降至0.53V。上述對比表明，NPC的存在會降低M點的跨膜電壓的幅值。圖4b為NPC對M點孔密度的影響。當M點無NPC時，M點的孔密度迅速上升至1.6×1018m?2；當M點存在NPC時，M點孔密度僅為1×107m?2，表明NPC的存在對周圍電穿孔特性有顯著性影響。

圖4 NPC對M點的跨膜電壓、孔密度的時間特性影響 Fig.4 The effect on the time characteristics of transmembrane voltage and pore density at piont M

為研究NPC分布對核膜電穿孔分布的影響，同時定量分析NPC有效作用區域，圖5分析了不同脈沖電場作用時刻（t=10ns, 30ns, 50ns）的跨膜電壓空間分布，其NPC的位置如圖5的黑色小圓所示。脈沖上升期間（t=10ns），NPC區域的跨膜電壓較NPC=0下降幅度最大可達55.3%，在脈沖作用期間與脈沖作用后，跨膜電壓的空間分布差異逐漸變大，表明NPC對周圍區域的電穿孔影響范圍也在逐漸擴大。

圖5 NPC對核膜的跨膜電壓空間特性影響， 圓圈代表NPC及其所在位置 Fig.5 The effect on the spatial characteristics of transmembrane voltage on nuclear membrane, where the circle represents NPC

圖6為脈沖電場作用后（t=50ns），NPC對核膜孔密度的影響。通過對比發現，NPC周圍的孔密度顯著性低于未設置NPC時的孔密度，如NPC-1、NPC-2區域內孔密度峰值減少90%以上，表明該部分區域由穿孔狀態轉變為穿孔程度較小甚至未穿孔狀態。

為進一步量化NPC影響范圍，小于初始孔密度N0的區域定義為未穿孔，同時定義電穿孔衰減系數αk為

圖6 NPC對核膜的孔密度空間特性影響 Fig.6 The effect on the spatial characteristics of pore density on nuclear membrane

式中，Ni為核膜上第i點在模型中沒有設定NPC條件下得到的孔密度數值；NNPCi為第i點在模型中設定NPC條件下得到的孔密度數值。電穿孔衰減系數αk達到90%以上且大于N0的區域定義為嚴重衰減；電穿孔衰減系數αk為50%～90%的區域定義為中度衰減；電穿孔衰減系數αk為10%～50%的區域定義為輕度衰減。

在模型中設定NPC個數為8的條件下，分別計算未穿孔和嚴重衰減區域（αk≥90%）大小，結果如圖7所示。

圖7 未穿孔、穿孔程度較小區域示意圖 Fig.7 The none-electroporation and less-electroporation regions of nuclear membrane produced by NPC

從圖7可明顯看出，因90°與270°區域本身在無NPC時不會發生電穿孔，所以，此區域即使存在NPC，也不會對結果產生明顯的影響。而在其他NPC周圍，均有一定區域內的核膜由電穿孔狀態轉變為穿孔程度較小甚至未穿孔狀態，其中，在45°、135°、225°、315°附近影響的范圍最廣，未穿孔、嚴重衰減的相位區域分別為1.68°、6.90°，而0°、180°附近的響應區域只有1.06°、3.88°，即不同位置下的NPC對核膜電穿孔影響程度不同，半徑方向電場強度較弱的區域對NPC相對敏感。弧長I與相位θ轉換公式為

經計算可得，在當前設定條件下，單一的NPC對細胞核膜電穿孔產生影響的范圍可達617.8nm，其中，距離NPC較近的66.6nm范圍內的細胞核膜由穿孔狀態轉變為未電穿孔狀態。

上述分析表明，NPC對細胞核膜附近區域電穿孔狀態具有顯著性影響，為研究NPC的存在及個數對整體細胞核膜上電穿孔的影響，本文分別計算了NPC個數分別為2、4、8、16、32時核膜未穿孔、電穿孔程度嚴重衰減、中度衰減、輕度衰減的區域大小，其中，NPC進行等距離分布，例如，當NPC=2時，每隔180°設置NPC；當NPC=16時，每隔22.5°設置NPC。核膜未穿孔、穿孔程度衰減區域隨NPC個數變化趨勢如圖8所示，區域百分比為核膜電穿孔衰減區域與沒有NPC存在時核膜的總電穿孔區域大小（23 774.58nm）的百分比值。

圖8 核膜未穿孔、穿孔程度衰減區域隨 NPC個數變化趨勢 Fig.8 The area size of none and decay electroporation and varies with the number of NPC

與無NPC存在下的電穿孔程度相比，隨著NPC個數的增加，未穿孔、穿孔程度衰減區域逐漸增加，當NPC=32，輕度衰減、中度衰減、嚴重衰減的區域分別為89.93%、36.00%、22.94%，表明絕大部分核膜電穿孔程度都因NPC的存在受到不同程度的影響；由電穿孔區域轉變為未穿孔區域的百分比為2.54%，而典型哺乳動物核膜NPC個數可達3 000～4 000（合成功能旺盛的細胞具有更多的NPC數量，而癌細胞普遍具有旺盛的合成功能），這必然導致核膜在一定電場強度下無法形成大面積電穿孔區域，造成類似“電場屏蔽”效果，從而影響基于電穿孔療法的治療效果。因此，在進行脈沖電場參數設計和優化過程中，應充分考慮NPC的存在導致核膜電穿孔效應衰減的影響。

本文通過兩種模型（傳統細胞五層介電模型和含核孔復合體的細胞五層介電模型）分析了細胞核膜上電穿孔的空間分布規律，通過對比表明，核孔復合體的存在會極大地降低其周圍細胞核區域電穿孔效應及整體細胞核電穿孔的程度。本文模型將核孔復合體設定為均勻分布，從而研究不同位置上核孔復合體對附近區域電穿孔程度的影響，然而，核孔復合體的數量、分布與細胞生理狀態關系密切，不同種類的哺乳細胞核復合體的數目及大小有所不同，即使是同一細胞在不同階段也會有所差異。后續將選取核孔復合體分布存在較大差異的哺乳類細胞，完善本文模型中核孔復合體的空間分布設置，并通過納秒脈沖電場細胞實驗，分析不同類別細胞的核膜電穿孔程度差異，進一步驗證仿真所得到的結論。

3 結論

本文建立了考慮NPC作用的五層介電模型，利用COMSOL軟件電流模塊和偏微分模塊分析了細胞電穿孔過程中的關鍵參數跨膜電壓、孔密度的時空變化特性，得到主要結論如下：

1）NPC的存在會導致附近一定區域內的核膜由電穿孔狀態轉變為未電穿孔，并且也會顯著性衰減周圍一定核膜區域的電穿孔程度，離核膜越近，其衰減程度越大，單一NPC（半徑為80nm）對核膜電穿孔產生影響的范圍可達617.8nm（衰減90%），其中，距離NPC較近的66.6nm范圍內的核膜由穿孔狀態轉變為未電穿孔狀態。

2）NPC附近核膜電穿孔衰減程度也與NPC的位置相關，半徑方向電場強度較弱的區域對NPC相對敏感。相位在45°、135°、225°、315°區域對NPC相對敏感，而在90°、270°區域設置核孔時對電穿孔的發展沒有影響。

3）隨著NPC數目的增加，與無NPC狀態下的電穿孔程度對比，核膜上電穿孔受影響的區域可達89.93%，而電穿孔程度嚴重衰減的區域也達到22.94%。較多數量的NPC將會產生類似“電場屏蔽”現象，嚴重影響基于納秒脈沖電場靶向作用細胞核進而治療腫瘤的效果。