基于DLL4/Notch1信號通路的麥粒灸對薄型子宮內膜大鼠血管生成的影響

沈真如，金純純，席瑾，劉靜玉，潘妍，李茜，程潔，沈潔，夏有兵，2，穆艷云

1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2.徐州醫科大學，江蘇 徐州 221004

薄型子宮內膜目前尚無明確定義，一般將排卵后期經陰道超聲檢查子宮內膜厚度不足7 mm 作為標準[1-2]。而子宮內膜厚度不足可導致子宮內膜容受性降低，子宮內膜容受性是胚胎著床過程中的重要因素[3]。Momeni 等[4]研究發現，當子宮內膜厚度≤7 mm時，胚胎植入率降低。內分泌失調、人工流產導致子宮內膜損傷增多，薄型子宮內膜也越發常見，臨床可表現為月經減少、閉經、不孕或反復流產等[5]。目前，臨床多采用雌激素、低劑量阿司匹林等治療方法，但效果欠理想，且有一定不良反應[6]。麥粒灸作為一種傳統中醫艾灸療法，具有促進組織修復、整體調節的優點，還能進一步激活機體防御系統，產生持久及多方面的調節作用，可彌補西藥治療的不足，減輕其不良反應[7]。血管生成受損和子宮血流量減少被認為是薄型子宮內膜形成的原因[8]。血管生成是女性生殖系統周期性變化的關鍵因素，除子宮內膜生長外，還包括黃體形成和卵泡發育[9]。Hahajan 等[10]報道，薄型子宮內膜病理生理特征可能與子宮動脈血流阻抗增加、血管內皮生長因子（VEGF）水平降低有關。VEGF、血管生成素-2（Ang-2）與子宮內膜厚度密切相關[11]。Notch 信號通路在胚胎發生、器官發育、血管生成中發揮重要作用，DLL4 是眾多Notch 配體中具有血管內皮細胞特異性的配體，是Notch 信號通路中調節血管生成的關鍵分子[12-13]。艾灸溫熱刺激可舒張血管，增加遠端血管的血流量[14]。本實驗基于DLL4/Notch1信號通路觀察麥粒灸對薄型子宮內膜大鼠子宮內膜組織VEGF、Ang-2 表達及血管生成的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF 級雌性SD 大鼠30 只，體質量（180±20）g，8～12 周齡，南京中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（滬）2018-0006。飼養于溫度（22±2）℃、相對濕度40%～60%環境，光照12 h，正常攝食飲水，適應性飼養1 周。每日上午固定時間進行大鼠陰道脫落細胞涂片，觀察其動情周期，待出現一個完整、正常動情周期后開始實驗。按隨機數字表法將大鼠分為對照組、模型組、麥粒灸組，每組10 只。實驗操作遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》，經南京中醫藥大學倫理委員會審查批準（202004A017）。

1.2 主要試劑與儀器

VEGF 抗體（貨號19003-1-AP）、Ang-2 抗體（貨號24613-1-AP），美國Proteintech 公司；Notch1 抗體（貨號3608S），美國CST 公司；DLL4 抗體（貨號ab183532），英國Abcam 公司；β-tubulin 抗體（貨號AB0039）、HRP 標記山羊抗兔IgG（貨號AB0101），中國Abways 公司；HRP 標記兔抗山羊IgG（貨號A21030），亞科因（武漢）生物技術有限公司；RIPA裂解液（貨號P0013B），上海碧云天生物技術有限公司；HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix（貨號11201ES03），上海翊圣生物科技有限公司；HE 染色試劑盒（貨號C0105），上海碧云天生物技術有限公司。吸入式氣體麻醉機（R550），深圳瑞沃德生命科技有限公司；石蠟組織包埋機（Tissue-Tek），日本Sakura公司；石蠟切片機（RM2235），德國Leica 公司；電泳儀（1645050），美國Bio-Rad 公司；實時熒光定量PCR 儀（Agilent Mx3000P），美國StrataGene 公司。

1.3 造模

參照文獻[15-16]方法造模。取動情期SD 大鼠，采用吸入式氣體麻醉機麻醉，仰臥位固定，腹部手術區備皮，常規消毒后，下腹部正中縱行切口（距恥骨聯合上約2 cm），長約2.5～3 cm，打開腹腔，無齒鑷輕輕將大鼠左側子宮拉直，用0 號縫合線活結結扎子宮近卵巢及近陰道端。無菌紗布墊于子宮周圍，于子宮頸上方0.5 cm 處用1 mL 注射器緩慢注入95%乙醇，使子宮保持充盈狀，針頭停留2 min，緩慢吸出95%乙醇，輕輕擠壓殘留液體，生理鹽水沖洗1～2次，無菌紗布將沖洗液擦干，回納子宮，為防止粘連，再用生理鹽水沖洗腹腔1～2 次，逐層縫合后碘伏消毒。術后連續3 d 肌內注射青霉素（8 萬U/只）預防感染。手術后密切觀察大鼠精神狀態、食納情況。

1.4 干預

參照《實驗針灸學》[17]定位，選取“關元”“子宮”（雙側）。麥粒灸組自造模次日起予麥粒灸治療，大鼠麻醉后腹部備皮，于施灸處涂抹適量凡士林，將麥粒型艾炷（約5 mg/壯）置于穴位處，用線香將其點燃，待大鼠施灸部位出現短暫收縮動作時移去剩余艾絨，每穴7 壯，1 次/d。對照組及模型組只麻醉固定15 min。嚴格規范執行各項操作，連續干預3 個動情周期（約15 d）。

1.5 取材

實驗結束后，頸椎脫臼處死大鼠，開腹取子宮，觀察子宮形態。取部分子宮組織，4%多聚甲醛固定，剩余子宮組織置于凍存管內，-80 ℃冰箱保存備用。

1.6 指標檢測

1.6.1 HE 染色

4%多聚甲醛固定大鼠子宮組織，石蠟包埋，切片（4 μm），行HE 染色，鏡下觀察大鼠子宮內膜形態。每個子宮組織隨機選取1 張切片，Image J 圖像處理軟件測定大鼠子宮內膜厚度（子宮內膜肌層交接處至宮腔的垂直距離），隨機選取4 個視野，以平均值作為該子宮組織內膜厚度。統計每張切片血管及腺體數目。

1.6.2 免疫組化染色

取大鼠子宮組織切片烘干，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫溶液浸泡10 min，滅活內源性過氧化物酶；PBS 浸洗后，抗原修復，自然冷卻至室溫；1%BSA 封閉1 h，滴加VEGF、Ang-2 一抗（1∶50），4 ℃孵育12 h；次日復溫并用PBS 浸洗，滴加二抗，孵育30 min；PBS 浸洗，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照，每張切片隨機選取4 個視野，Image Pro Plus 圖像處理軟件測定VEGF、Ang-2 的平均光密度（MOD）。

1.6.3 Western blot 檢測

取大鼠子宮組織，冰上刮取子宮內膜，加入適量預冷的RIPA 裂解液，裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液測定蛋白濃度；蛋白樣品經8% SDS-PAGE 進行電泳，轉膜，5%BSA 封閉1 h；加入Notch1（1∶1 000）、DLL4（1∶1 000）、β-tubulin 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育12 h；TBST 洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h；TBST 洗膜3 次，暗室中曝光顯影，以β-tubulin 為內參，采用Image J 圖像處理軟件測定Notch1、DLL4 蛋白相對表達量。

1.6.4 RT-qPCR 檢測

提取大鼠子宮內膜組織總RNA，根據反轉錄試劑盒合成cDNA。按試劑盒說明書進行熒光定量PCR檢測。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設計與合成，見表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.7 統計學方法

采用SPSS21.0 統計軟件進行分析。實驗數據以表示，多組間比較采用方差分析，Levene 檢驗方差齊性，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnet’s T3法；不服從正態分布用非參數統計的秩和檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 麥粒灸對模型大鼠子宮內膜形態的影響

對照組大鼠動情期子宮組織結構完整，子宮內膜腺上皮及腔上皮細胞形態正常，呈單層立方狀，腺體密集、血管豐富；模型組大鼠動情期子宮組織結構不完整，子宮壁全層變薄，腺上皮及腔上皮細胞多呈扁平、低柱狀，內膜組織血管稀疏、腺體減少；麥粒灸組大鼠動情期子宮組織結構基本完整，子宮內膜表面呈波浪形，腺上皮及腔上皮細胞形態較為正常，腺體較少，部分區域新生毛細血管增多。見圖1。與對照組比較，模型組大鼠子宮內膜厚度明顯變薄，腺體數及血管數目明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，麥粒灸組大鼠子宮內膜厚度增加，腺體數及血管數目明顯增多（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2。

圖1 各組大鼠子宮內膜形態（HE 染色）

圖2 各組大鼠子宮內膜厚度、腺體數及血管數目比較（，每組5只）

2.2 麥粒灸對模型大鼠子宮內膜組織血管內皮生長因子、血管生成素-2蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠子宮內膜組織VEGF、Ang-2蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，麥粒灸組大鼠子宮內膜組織VEGF、Ang-2蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見圖3～圖5。

圖4 各組大鼠子宮內膜組織Ang-2 陽性表達（免疫組化染色）

圖5 各組大鼠子宮內膜組織VEGF、Ang-2蛋白表達比較（，每組5只）

2.3 麥粒灸對模型大鼠子宮內膜組織Notch1、DLL4蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠子宮內膜組織Notch1、DLL4蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，麥粒灸組大鼠子宮內膜組織Notch1、DLL4蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖6、圖7。

圖6 各組大鼠子宮內膜組織Notch1、DLL4蛋白免疫印跡圖

圖7 各組大鼠子宮內膜組織Notch1、DLL4 蛋白表達比較（，每組5只）

2.4 麥粒灸對模型大鼠子宮內膜組織血管內皮生長因子、血管生成素-2、Notch1、DLL4 mRNA 表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠子宮內膜組織VEGF、Ang-2、Notch1、DLL4mRNA 表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，麥粒灸組大鼠子宮內膜組織VEGF、Ang-2、Notch1、DLL4mRNA表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖8、圖9。

圖8 各組大鼠子宮內膜組織VEGF、Ang-2mRNA 表達比較（，每組5只）

圖9 各組大鼠子宮內膜組織Notch1、DLL4 mRNA 表達比較（，每組5只）

3 討論

子宮內膜是一個復雜的動態組織，包括基底層和功能層，排卵后螺旋動脈血管收縮，流向功能層血液減少，減少氧張力有助于胚胎植入[18]。當子宮內膜變薄時，胚胎植入更靠近基底層，具有更多的血流和較高的氧張力，從而導致活性氧產生，不利于胚胎的發育和植入[19]。研究顯示，子宮內膜過薄會影響子宮內膜容受性并顯著降低胚胎著床率[20-21]。

VEGF和Ang-2是促進血管生成的重要因子。血管生成是行經后子宮內膜再生的必需過程，對子宮內膜容受性也起著至關重要的作用[22]。許多血管生成因子已被證實與子宮內膜血管的發育和分化有關。VEGF 是包括子宮內膜在內的多種組織中血管生長和重塑的關鍵介質，可直接作用于血管內皮細胞，促進新生血管形成[23-24]。Takasaki 等[25]推測，薄型子宮內膜血管發育不良可能由于子宮內膜VEGF水平較低，影響子宮內膜容受性。Ang-2作為促進血管形成的重要因子之一，能與血管內皮細胞特異性酪氨酸激酶受體結合，進而影響血管的穩定性，且與VEGF密切相關[26]。萬秋園等[27]研究表明，益母草總生物堿可增加薄型子宮內膜大鼠VEGF、Ang-2的表達，促進子宮內膜血管生成，改善子宮內膜厚度。

DLL4/Notch1信號通路在子宮內膜細胞、胚胎、胎盤組織中均有調控血管發育的作用[12]。Notch 通路參與調節多種細胞的分化和發育，在胚胎發育、細胞增殖分化、腫瘤轉移、干細胞分化調節等方面扮演重要角色[13]。DLL4是一種跨膜蛋白，作為Notch配體DLL4基因缺失會導致胚胎和產后血管發育嚴重異常[28]。研究發現，在反復著床失敗患者的子宮內膜中Notch1表達降低可能抑制VEGF受體（VEGFA）活性，使VEGFA 和DLL4/Notch1的平衡狀態被打破，最終導致胚胎反復種植失敗[29]。

麥粒灸屬直接灸，其灼熱、灼痛感穿透性明顯。灸法可通過激發經氣起到整體調節作用，具有溫經通絡、活血散瘀等功效，還能調節機體免疫功能[30]。關元為任脈穴，又為足三陰經交會穴，還與胞宮、沖脈、督脈聯系密切，具有補腎固本、通調陰陽、和血理沖任之效。研究表明，艾灸關元等穴可有效促進子宮動脈血流，改善子宮內膜發育情況，提高妊娠率[31]。子宮屬經外奇穴，為子宮在腹部的體表投影，艾灸該穴可起到溫煦子宮、改善子宮血流的作用[32]。本課題組前期研究發現，麥粒灸可提高薄型子宮內膜大鼠子宮內膜容受性相關因子同源框轉錄因子HOXA10、白血病抑制因子、波形蛋白、角蛋白和VEGF 表達，改善大鼠子宮內膜形態，誘導血管再生，調節大鼠子宮內膜微環境[33]。

本實驗結果顯示，95%乙醇宮腔注射后，大鼠子宮結構不完整，腺體稀疏萎縮，血管數量減少，子宮內膜顯著變薄，子宮內膜組織VEGF、Ang-2蛋白和mRNA 表達顯著降低，與血管生成相關的Notch信號通路Notch1、DLL4蛋白和mRNA 水平顯著下調，提示造模后血管生成嚴重受損。麥粒灸“關元”“子宮”可改善薄型子宮內膜大鼠宮腔形態，促進上皮細胞與間質細胞生長，增加子宮內膜厚度及腺體和血管數目，顯著提高大鼠子宮內膜組織VEGF、Ang-2蛋白和mRNA 表達，促進血管生成。進一步探討其機制發現，麥粒灸可上調Notch信號通路相關分子Notch1、DLL4蛋白和mRNA 水平。本實驗初步探討麥粒灸對薄型子宮內膜大鼠血管生成的影響，從DLL4/Notch1信號通路分析其可能的作用機制，而VEGF與Notch信號通路在血管生成過程中的相互作用及機制還需今后進一步研究。