基于Myh6啟動子的藥物篩選系統在中藥有效成分誘導P19向心肌細胞分化中的應用

李涵，邵長樂，王亞超，邵水金，國海東

上海中醫藥大學基礎醫學院人體解剖學教研室，上海 201203

心血管疾病是當今世界人類死亡的最主要原因，尤其是心肌梗死（myocardial infarction，MI）病死率呈快速上升趨勢[1]。MI 發生后，死亡的心肌細胞被成纖維細胞所代替，引起心室重構和瘢痕形成，最終可能導致心力衰竭，甚至死亡。近20 年，通過干細胞移植修復壞死心肌為治療MI 帶來新的希望[2]，但由于心肌局部組織缺血缺氧，嚴重影響干細胞移植后的存活和分化效率[3]，尤其是干細胞只有分化為心肌細胞后，才能發揮替代壞死心肌細胞的作用，從而達到治療MI 的目的。干細胞移植后向功能性心肌細胞定向分化需要精細的調控和合適的誘導環境[4]。

誘導干細胞向心肌細胞分化的手段主要包括擬胚體生成法、細胞共培養、生長因子等方法[5]。這些誘導方法需要進一步優化以提高誘導效率及誘導后心肌細胞的功能。中藥可能含有誘導干細胞向心肌細胞分化的有效成分。已有諸多關于中藥有效成分誘導干細胞向心肌細胞分化的研究報道[6]。三七是臨床治療心血管疾病的常用中藥，含有多種三七皂苷和人參皂苷，其是否對干細胞向心肌細胞分化具有一定的誘導作用值得研究。然而，目前有關中藥誘導干細胞定向分化的研究比較單一，缺乏有效的篩選措施，不能系統地比較各種有效成分的誘導效率。

由Myh6 編碼的α-肌球蛋白重鏈（α-myosin heavy chain，α-MHC）是心肌特有的蛋白[7]。雖然心肌肌球蛋白輕鏈2V（myosin light chain 2V，MLC2V）和心肌肌鈣蛋白T（cTnT）啟動子也能作為向心肌分化的標記，但Myh6 啟動子向心肌分化的特異性高于MLC2V 和cTnT 啟動子，因此，用Myh6 示蹤干細胞向心肌細胞分化的特異性比MLC2V 和cTnT 高[8]。本研究將Myh6 基因的啟動子區域克隆并插入pGL6報告質粒熒光素酶基因的上游，構建心肌細胞特異啟動子熒光素酶報告基因系統（Myh6-Luc），以高效靈敏地篩選向心肌細胞分化的中藥誘導劑。

1 實驗材料

1.1 藥物

三七素（批號19103029）、三七皂苷Fa（批號19050623）、三七皂苷Fe（批號19102821）、三七皂苷R1（Notoginsenoside R1，NGR1，批號19071624）、人參皂苷Rb1（批號19030522）、人參皂苷Rb2（批號19090421）及人參皂苷Rh1（批號19011421），上海同田生物技術公司，純度≥98%。

1.2 細胞

小鼠畸胎瘤細胞P19，賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

無內毒素質粒大提試劑盒（貨號DP117）、miRcute miRNA 提取分離試劑盒（貨號DP501）、miRcute 增強型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（貨號FP411），天根生化科技有限公司；DH5α 感受態（貨號D0351）、pGL6 質粒（貨號D2102），上海碧云天生物技術有限公司；限制性內切酶KpnⅠ（貨號R3142S）、BglⅡ（貨號R0144S），美國New England Biolabs；PCR 試劑盒（貨號B639293），生工生物工程（上海）股份有限公司；MEM-α 培養基（貨號iCell-0003），賽百慷（上海）生物技術股份有限公司；0.25%胰蛋白酶（貨號25-053-CIa）、PBS（貨號21-040-CV）、雙抗（貨號30-002-CIa），美國Corning；澳洲胎牛血清（貨號10099141C）、轉染試劑Lipofectamine 2000（貨號11668-027），美國Thermo Fisher Scientific；二甲基亞砜（DMSO，貨號D2650-5X10ML），美國Sigma-Aldrich；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號E1910），美國Promega 公司；cTnT 抗體（貨號15513-1-AP），美國Proteintech 公司；熒光二抗（貨號4412S），美國CST 公司；VECTASHIELD 抗熒光淬滅封片劑（貨號H-1200），美國Vector Labs 公司。全自動凝膠成像系統（2500R，上海天能），電泳儀（EPS300，上海天能），電熱恒溫水浴鍋（HWS-24，上海一恒），多功能酶標儀（Synergy HT，美國BioTek 公司），細胞培養箱（371，美國Thermo Fisher Scientific），倒置熒光顯微鏡（IX51，日本Olympus 公司）。

2 實驗方法

2.1 Myh6-Luc 重組質粒構建

根據pGL6 上的酶切位點和Myh6啟動子序列（～1 507 bp），選擇KpnⅠ和BglⅡ雙酶切，將酶切位點引入PCR 產物中。用P19 細胞基因組作為模板，通過PCR 調取Myh6 啟動子序列。將PCR 產物進行跑膠回收，37 ℃水浴鍋進行KpnⅠ和BglⅡ雙酶切反應。同時對pGL6 進行KpnⅠ和BglⅡ雙酶切。將酶切后pGL6 載體和酶切后Myh6 通過T4 DNA 連接酶進行連接。取上述連接產物轉化DH5α 感受態，涂板過夜培養。篩選陽性克隆用雙酶切進行鑒定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因測序。

2.2 P19 細胞培養

將P19 細胞接種于25 cm2細胞培養瓶，用含10%胎牛血清和1%雙抗的MEM-α 培養基常規培養，待細胞生長至80%～90%進行細胞傳代。將細胞接種至24 孔板，設置不同分組，培養24 h。

2.3 質粒轉染

細胞接種后培養24 h，待細胞密度達到70%～80%，進行質粒轉染，轉染前1 h 更換不含血清的培養液，隨后將質粒pRL-SV40 和Myh6-Luc 按1∶15比例通過轉染試劑Lipofectamine 2000 進行轉染，轉染試劑與質粒的比例為2∶1，轉染混合物與培養基的比例為1∶10。轉染6～8 h 后吸棄培養基，換成新的完全培養基。轉染第2 日使用誘導劑進行誘導，誘導7 d，期間每日更換含誘導劑的培養基。

2.4 雙熒光素酶檢測

誘導結束后吸去細胞上清液，PBS 漂洗細胞，加入1×PLB 裂解液，室溫輕輕晃動培養板15 min 進行裂解，裂解結束后將液體吸出，12 000 r/min 離心5 min，吸取上清液，置于黑色圓底96 孔板，每孔加入20 μL上清液。設置自動進樣器1 和2 分別為LARⅡ和Stop&Glo?試劑，每孔加入100 μL LARⅡ檢測螢火蟲熒光素酶活性，然后加入100 μL Stop&Glo?試劑檢測海腎熒光素酶活性，檢測時設置1～2 s 延遲和5～10 s 讀數，之后對檢測數據進行統計分析。

2.5 免疫熒光染色

誘導結束后，吸去細胞上清液，PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定30 min；滴加0.5% Triton X-100，室溫處理10 min 破膜，增加細胞膜通透性；PBS 洗3次；山羊血清37 ℃封閉30 min，封閉非特異性結合位點；滴加cTnT 一抗（1∶50）于4 ℃下孵育過夜；PBS 洗3 次，滴加熒光二抗（1∶500），37 ℃孵育1 h；PBS 洗3 次，每次10 min。抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并進行拍照。

2.6 RT-qPCR 檢測

誘導結束后，通過miRcute miRNA 提取分離試劑盒提取細胞miRNA，每組各取1 μg miRNA，采用miRNA 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。將miRcute 增強型miRNA 熒光定量檢測試劑盒中 2×miRcute Plus miRNA Premix、Reverse Primer 和50×ROX Reference Dye 在冰上融化，配制反應體系后進行qPCR 檢測。反應條件：95 ℃變性15 min；94 ℃、20 s，60 ℃、34 s，45 個循環。

3 統計學方法

以螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值比值計算相對熒光素酶活性。采用SPSS23.0 統計軟件進行分析。實驗數據以表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用方差分析（LSD-t）。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 Myh6-Luc 構建與鑒定

瓊脂糖凝膠電泳成像顯示，KpnⅠ/BglⅡ雙酶切后出現1 507 bp 和5.5 k 兩條特異性條帶，條帶大小與理論值相吻合，見圖1。經基因測序后發現，插入的基因序列與Myh6 啟動子序列完全一致。表明心肌細胞特異啟動子Myh6-Luc 重組質粒構建成功，可用于后續篩選實驗。

圖1 Myh6-Luc 報告質粒的構建與酶切鑒定

4.2 熒光素酶報告基因體系驗證

實驗分為對照組（包括未轉染和轉染）和陽性誘導劑DMSO 組（包括未轉染和轉染）。DMSO 濃度為0.005%，誘導7 d 后進行雙熒光素酶活性檢測。結果顯示，未轉染的對照組和DMSO 組相對熒光素酶活性較低。與對照組（轉染）比較，DMSO 組（轉染）相對熒光素酶活性顯著提高，表明熒光素酶報告基因體系建立成功，見圖2。

4.3 中藥單體篩選

利用熒光素酶報告基因系統對三七素、三七皂苷Fa、三七皂苷Fe、NGR1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 及人參皂苷Rh1 共7 種中藥單體進行篩選。每種藥物設置0.01、0.1、1、10 μmol/L 4 個濃度，對照組不加任何誘導劑。誘導7 d 后進行雙熒光素酶活性檢測。結果顯示，與對照組比較，0.1 μmol/L 三七皂苷Fe、1 μmol/L NGR1 和10 μmol/L 人參皂苷Rh1 組相對熒光素酶活性顯著升高，其中1 μmol/L NGR1 誘導效果最明顯。低濃度三七素（0.01、0.1、1 μmol/L）、高濃度三七皂苷Fe（1、10 μmol/L）及中濃度人參皂苷Rb2（0.1、1 μmol/L）能顯著抑制相對熒光素酶活性，見圖3。

圖3 不同濃度三七素、三七皂苷Fa、三七皂苷Fe、NGR1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 和人參皂苷Rh1 對Myh6 啟動子活性的影響（，n＝6）

4.4 1 μmol/L NGR1 誘導效果驗證

通過免疫熒光染色驗證1 μmol/L NGR1 誘導P19細胞向心肌細胞分化效果，實驗分為P19 組和P19＋NGR1 組。結果顯示，1 μmol/L NGR1 誘導7 d 后，大部分P19 細胞表達cTnT，表明1 μmol/L NGR1 能成功誘導P19 細胞向心肌細胞分化，見圖4。

圖4 NGR1 誘導后P19 細胞cTnT 陽性表達（免疫熒光染色，Bar＝100 μm）

4.5 1 μmol/L NGR1 對P19 細胞miR-1 和miR-25 表達的影響

為進一步探討1 μmol/L NGR1 誘導P19 細胞向心肌細胞分化的作用機制，通過RT-qPCR 檢測誘導7 d后miR-1 和miR-25 mRNA 表達，實驗分為P19 組和P19＋NGR1 組。結果顯示，與P19 組比較，1 μmol/L NGR1 誘導后miR-1 表達顯著升高，miR-25 表達顯著降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 NGR1 對P19 細胞miR-1 和miR-25 表達的影響（，n＝6）

5 討論

雙熒光素酶報告基因系統是以熒光素為底物檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報告系統。可以通過化學發光儀檢測氧化過程中釋放的生物熒光，從而靈敏、高效地檢測基因的表達，是檢測轉錄因子與目的基因啟動子區DNA 相互作用的一種方法。螢火蟲熒光素和海腎熒光素是常用的報告基因，通過氧化不同底物產生可定量的熒光[9]。Koley 等[10]采用心鈉素（atrial natriuretic factor，ANF）啟動子熒光素酶報告系統對小分子化合物進行篩選，發現VUT-MK142 可促進心臟前中胚層向心肌細胞分化。ANF 是一種主要在心肌細胞中合成的多肽激素。本研究中，我們將Myh6 基因的啟動子區域克隆并插入pGL6 報告質粒熒光素酶基因的上游，得到報告質粒Myh6-Luc，構建心肌細胞特異啟動子熒光素酶報告基因系統。瓊脂糖凝膠電泳實驗、基因測序和雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，報告基因質粒Myh6-Luc 構建成功。

通過該篩選系統發現，藥物濃度對誘導P19 細胞向心肌細胞分化具有較大的影響。如10 μmol/L 三七素對P19 細胞分化無影響，0.01、0.1、1 μmol/L 三七素卻顯著抑制熒光素酶活性；0.1 μmol/L 三七皂苷Fe可促進P19 細胞向心肌細胞分化，而1、10 μmol/L 三七皂苷Fe 可抑制P19 細胞向心肌細胞分化；1 μmol/L NGR1 誘導效果十分明顯。李晨琳等[11]發現，中濃度牡蠣蛋白肽對大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）誘導分化作用最強，且顯著高于高濃度的誘導作用。低濃度骨碎補總黃酮能促進大鼠BMSCs 向成骨細胞分化[12]。也有研究發現，中濃度5-氮胞苷是誘導BMSCs向心肌細胞分化的最適濃度[13]。因此，在中藥單體篩選中應重視藥物不同濃度的影響。此外，本研究只檢測了7 種中藥單體的誘導作用，在今后的研究中，可利用該系統對更多的中藥單體成分進行檢測，尤其臨床治療心血管疾病的常用中藥單體，從而篩選出更為有效的中藥誘導劑。

NGR1 是中藥三七的主要活性成分，其能保護H9C2 心肌細胞對抗缺氧損傷[14]，提高H9C2 細胞的存活率，維持肌動蛋白骨架和線粒體形態，減少氧糖剝奪后復氧誘導的細胞凋亡[15]，對心肌細胞有直接的抗炎、抗凋亡作用[16]。還有研究發現，三七總皂苷能促進BMSCs 體外增殖和向心肌樣細胞分化[17]。P19細胞是體外細胞誘導分化最常用的細胞系，雖然本研究發現1 μmol/L NGR1可激活P19細胞Myh6啟動子，并通過免疫熒光染色進行驗證，但仍應在胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）和誘導性多能干細胞上進一步驗證，并在此基礎上開展動物實驗，為臨床應用NGR1 治療缺血性心肌病提供更多實驗依據。此外，除用DMSO 作為陽性誘導劑外，10 nmol/L 全反式維甲酸也可促進ESC 向心肌細胞分化[18]。

在干細胞向心肌細胞分化的過程中多種miRNA表達發生變化。miR-1 在調控心肌祖細胞分化中起著重要作用，可促進移植ESC 向心肌細胞分化，并抑制MI 后細胞凋亡[19]。miR-1 和miR-133 可能在小鼠ESC 心肌細胞分化過程中發揮重要作用，并且Cdk9可能作為miR-1 的靶點參與這一過程[20]。有研究發現，miR-25 能明顯抑制P19 細胞向心肌細胞分化，其作用機制可能與調控Notch 信號通路有關[21]。本實驗發現，1 μmol/L NGR1 誘導后可顯著提高miR-1 的表達，同時抑制miR-25 的表達。因此，NGR1 誘導P19 細胞向心肌細胞分化的機制可能與上調miR-1 和下調miR-25 的表達有關，其具體作用機制需進一步研究。

綜上，本研究成功構建雙熒光素酶報告基因系統Myh6-Luc，通過該系統可有效篩選向心肌細胞分化的中藥有效成分，并且發現1 μmol/L NGR1 能成功誘導P19 細胞向心肌細胞分化，其作用機制與上調miR-1表達、下調miR-25 表達有關。本研究為誘導干細胞向心肌細胞分化提供了新的手段和工具，也為優化干細胞移植治療MI 等心血管疾病提供了參考和依據。