基于TGF-β1/Smads通路的鹿紅方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響

楊曉利，瞿惠燕，戎靖楓，楊天舒，蘭真真，周華，

1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203；3.上海市中西醫結合心血管病研究所，上海 201203

心力衰竭是一種由于心室收縮或舒張功能受限，導致心室不能正常射血而引起心臟組織灌注不足、靜脈系統淤血等表現的循環障礙疾病[1]，是各種心臟疾病最終階段。我國約有450 萬心力衰竭患者，并以每年50 萬人速度增長[2]。如何有效防治慢性心力衰竭已成為目前心血管疾病亟需攻克的難題。研究表明，心力衰竭的發病原因以心肌梗死最為常見，其關鍵病理機制為心室重構[3]，而心室重構的基礎病理變化是心肌纖維化[4]。故尋找防治心肌纖維化，延緩心室重構，減少心肌梗死后心力衰竭的藥物尤為重要。研究表明，轉化生長因子-β1（TGF-β1）是促進膠原和纖維連接蛋白合成與沉積的關鍵因子，可刺激下游Smads蛋白在心肌纖維化中發揮重要作用[5-7]。盡管西醫治療可在一定程度上改善心肌纖維化，降低心力衰竭的發病率和死亡率，但長期使用存在耐藥性及不良反應。中醫藥治療具有多環節、多靶點干預的優勢，可有效改善慢性心力衰竭。鹿紅方是周華教授依據“心腎相關”理論及多年臨床經驗研制的院內制劑，具有溫補心腎、活血通絡功效，與目前臨床常見的陽虛血瘀型心力衰竭契合。課題組前期臨床及基礎研究顯示，鹿紅方能顯著改善心功能、抑制心臟間質重構、延緩心力衰竭的發展[8-11]。本研究以心肌梗死后心力衰竭大鼠為模型，基于TGF-β1/Smads 通路探討鹿紅方對心肌纖維化的影響，進一步明確其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級Wistar 雄性大鼠60 只，體質量（213±27）g，8 周齡，上海中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SYXK（滬）2017-0014，動物實驗倫理號SZY201807001。飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，溫度（25±1）℃、濕度30%攝食，自由飲水，光照周期12 h，適應性飼養1 周后進行實驗。

1.2 藥物

鹿紅方（鹿角片15 g，紅花9 g，補骨脂20 g，淫羊藿30 g，女貞子30 g，山萸肉15 g，沉香6 g），飲片均為顆粒劑，江陰天江藥業有限公司提供；培哚普利片，8 mg/片，施維雅（天津）制藥有限公司，批號190527-02。

1.3 主要試劑與儀器

TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 引物，上海擎熙生物科技有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox），瑞士Roche 公司，貨號04913 914001；HyPureTMMolecular Biology Grade Water，美國HyClone 公司，貨號SH30538.02；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，美國Thermo 公司，貨號#K1622。Masson 組織芯片掃描儀，匈牙利3DHISTECH 公司，型號Pannoramic 250；小型動物呼吸機，江西特力公司，型號TIC-200A；彩色多普勒超聲，美國GE 公司，型號Voluson i；顯微鏡，日本Olympus，型號4kx41；熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司，型號7300。

1.4 造模

大鼠適應性喂養1 周，術前12 h 禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）麻醉，固定于手術板上，剪去胸部毛發，連接心電圖機，記錄術前心電圖。持氣管插管向下輕輕按壓大鼠舌根部，充分暴露會厭區，待氣管開放迅速插入氣管插管，連接呼吸機，見胸廓起伏與呼吸機頻率一致為插管成功。消毒心前區，于左側胸部第4～5 肋間心臟搏動最強處剪開長約1 cm 皮膚，剝離橫紋肌和豎紋肌，撐開肋間肌，充分暴露心臟，撕開心包膜，找到左心耳，在距左心耳根部1 mm 處結扎左冠狀動脈前降支，結扎處心肌顏色由紅轉白、心臟跳動節律逐漸減弱、心電圖Ⅱ導聯顯示ST 段呈現弓背向上抬高，表明心肌梗死模型制備成功[12-13]。立即將心臟回位，止血后縫合肌肉、皮膚，大鼠恢復自主呼吸后撤掉呼吸機，右側臥位于恒溫墊上至大鼠蘇醒，予以水和食物并密切觀察術后情況。術后14 d 行超聲心動圖檢查，左室射血分數（LVEF）≤50%表明心肌梗死后心力衰竭模型制備完成[14]。假手術組只縫合不結扎。

1.5 分組及給藥

大鼠隨機分為假手術組、模型組、培哚普利組和鹿紅方低、中、高劑量組，每組10 只。成模后灌胃給藥，給藥劑量參照成人每日常用劑量進行換算[15]，鹿紅方低劑量組0.625 g/kg、中劑量組1.25 g/kg、高劑量組2.5 g/kg，培哚普利組2 mg/kg，假手術組和模型組予等體積生理鹽水。給藥體積1 mL/kg，每日1 次，連續8 周。

1.6 心臟功能觀察

藥物干預8 周后，稱量大鼠體質量，1%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，彩色多普勒超聲檢測各組大鼠LVEF 及縮短分數（FS）。

1.7 病理觀察

大鼠麻醉后開胸，剪斷主動脈，取出心臟，PBS沖洗，切除部分心臟組織放入多聚甲醛溶液中，經脫水、包埋、切片等程序后進行HE 和Masson 染色。基于Masson 染色結果，使用Image Pro Plus 6.0 計算心肌膠原容積分數（CVF），即心肌膠原面積占全視野面積的百分比。

1.8 轉化生長因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達檢測

取大鼠心肌組織，Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 濃度，反轉錄試劑盒獲得cDNA，按PCR 試劑盒說明書進行反應：95 ℃預變性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，循環40 次，75～95 ℃每20 s 升溫1 ℃，繪制融解曲線。以GAPDH 為內參，運用PCR 儀分析實驗結果，得到樣品的Ct 值，并計算ΔCt，采用2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.9 轉化生長因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表達檢測

取100 mg 心肌組織，剪碎后加入1 mL RIPA 裂解液（含10 μL PMSF），冰上勻漿10 s×3 次，靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度；上樣，電泳（75 V、20 min，120 V、20 min），200 mA 轉膜1 h，5%脫脂牛奶封閉1 h；滴加TGF-β1 一抗（1∶200）、Smad2 一抗（1∶400）、Smad3 一抗（1∶400）和Smad7 一抗（1∶400），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜5 min×3 次，加入二抗（1∶3 000）室溫孵育30 min，TBST 洗膜5 min×3 次；ECL 發光液顯影，凝膠成像系統成像，以GAPDH 為內參，使用Alpha3.2.0.8 分析目的蛋白條帶灰度值。

1.10 統計學方法

采用SPSS25.0 統計軟件進行分析。計量資料以表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況

假手術組大鼠未出現死亡情況，模型組大鼠因水腫較重死亡4 只，培哚普利組死亡2 只，鹿紅方低劑量組死亡2 只，鹿紅方中、高劑量組各死亡1 只。模型組大鼠術后食欲明顯減退，毛發缺乏光澤，活躍度明顯降低，體質量明顯減輕，各給藥組大鼠上述情況較模型組均有所改善。

2.2 鹿紅方對模型大鼠心功能的影響

與假手術組比較，模型組大鼠LVEF、FS 明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方低、中、高劑量組及培哚普利組大鼠LVEF、FS 明顯升高（P＜0.01）；與培哚普利組比較，鹿紅方中、高劑量組大鼠LVEF、FS 明顯升高（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠LVEF、FS 比較（，%）

表2 各組大鼠LVEF、FS 比較（，%）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與培哚 普利組比較，▲P＜0.05

2.3 病理觀察結果

HE 染色顯示，假手術組心肌細胞排列較緊密，分界輪廓較清晰，未見細胞壞死，間質內有少量肥大細胞浸潤；模型組大鼠心肌細胞排列紊亂無序，局部出現心肌細胞消失，被大量增生的結締組織替代，心肌細胞明顯水腫甚至壞死，結締組織內存在大量淋巴細胞浸潤，局部可見較多肥大細胞；鹿紅方低、中、高劑量組及培哚普利組大鼠結締組織增生相對減少，可見少量淋巴細胞浸潤，心肌細胞水腫、壞死及纖維化程度均有不同程度減輕。結果見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織形態（HE 染色，×100）

Masson 染色顯示，模型組大鼠心臟組織出現大量膠原纖維沉積，心肌纖維化病變比較明顯，局部有大量肌纖維斷裂、萎縮變性，梗死區域附近存在大量炎性細胞浸潤；鹿紅方低、中、高劑量組及培哚普利組大鼠心臟組織膠原纖維沉積減少，炎性細胞浸潤減輕，局部肌纖維斷裂和萎縮變性程度均有所改善。結果見圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織形態（Masson 染色，×20）

與假手術組比較，模型組大鼠CVF 升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方低、中、高劑量組及培哚普利組大鼠CVF 顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠CVF 比較（，%）

表3 各組大鼠CVF 比較（，%）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.4 鹿紅方對模型大鼠轉化生長因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達顯著升高，Smad7 mRNA表達顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方中、高劑量組及培哚普利組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達明顯降低，Smad7 mRNA 表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01），鹿紅方低劑量組大鼠心肌組織Smad2、Smad3 mRNA 表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。結果見表4。

表4 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表達比較（）

表4 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表達比較（）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

2.5 鹿紅方對模型大鼠轉化生長因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達明顯升高（P＜0.01），Smad7蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方低、中、高劑量組及培哚普利組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2 蛋白表達明顯降低，Smad7 蛋白表達明顯升高（P＜0.01），鹿紅方中、高劑量組及培哚普利組大鼠心肌組織Smad3 蛋白表達明顯降低（P＜0.01）。結果見表5、圖3。

表5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表達比較（）

表5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表達比較（）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

圖3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白免疫印跡圖

3 討論

心肌損傷后，心肌組織纖維化改變導致的心室重構是心力衰竭的主要病理機制[16-17]，亦是構成心力衰竭患者預后不佳的主要因素。研究顯示，TGF-β1/ Smads 信號通路是引起心肌纖維化的經典途徑，其中TGF-β1 是心肌纖維化引起心室重構的關鍵調控因子，具有強促纖維化作用，可促進成纖維細胞的膠原增生與合成及纖維連接蛋白的沉積[18]。TGF-β1 通過激活Smads 蛋白促進成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，引起細胞外基質大量沉積，導致心肌纖維化，誘發心力衰竭[19-21]。研究表明，以Smad2、Smad3 為代表的受體調節蛋白被磷酸化后，可與Smad4 通用蛋白結合[22]，TGF-β1 可刺激進入細胞核的Smad4，激活纖維化相關基因轉錄，增強心肌纖維化。Smad7 能使Smad2、Smad3 的磷酸化受到抑制，發揮抗纖維化作用，TGF-β1 可通過抑制Smad7 激活Smad2 和Smad3而起到負調節效應[23]。因此，基于TGF-β1/ Smads 信號通路尋求防治心肌纖維化的策略為心力衰竭治療提供了新方向。

心力衰竭屬中醫學“心痹”“水腫”等范疇，其基本病因可概括為心氣虛，以虛、瘀、水為特點。鹿紅方方中鹿角片溫腎益精、行血消腫，紅花活血祛瘀止痛，二者同用達到通利心脈、溫陽活血效果，共為君藥；補骨脂補腎助陽、納氣平喘，淫羊藿溫腎壯陽、強筋健骨，二者聯用增強鹿角溫補腎陽的作用，共為臣藥；山萸肉補益肝腎、收斂固澀，女貞子補益肝腎、清除虛熱，沉香溫腎降逆、納氣平喘，三者共為佐藥。全方以補虛為本，兼顧瘀血，滋陰補陽，重在補陽，達到陰中求陽的目的。心腎相交，心本乎腎，從而達到溫腎強心的作用。以上藥物相互配合使用，與心腎兩臟陽氣不足，無力行血導致血脈不暢，水飲停滯的病機相對應。臨床上鹿紅方可改善慢性心力衰竭患者臨床癥狀及心功能，顯著改善心肌纖維化[24]。基礎實驗表明，鹿紅方可有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠的心臟間質重構[25-27]，其中鹿角能增強心肌收縮力，改善冠脈血流和心肌重構，調節心肌能量代謝，進而延緩心力衰竭進程補充文獻[28]；紅花可抑制心臟重構，延緩脂多糖誘導的心肌纖維化[29]；補骨脂能增強大鼠超氧化物歧化酶活性，使心肌組織中丙二醛含量與體內氧自由基減少，從而抑制慢性心力衰竭心肌損傷[30]；淫羊藿苷可改善心功能，延緩心肌纖維化，逆轉心室重構[31]；山萸肉、女貞子中齊墩果酸等成分可增強心肌收縮力，改善心肌纖維化[32]。

本研究發現，鹿紅方能提高模型大鼠LVEF 和FS，改善心功能，減少心肌組織炎性細胞浸潤、結締組織增生、心肌纖維化，下調TGF-β1、Smad2 及Smad3 mRNA 和蛋白表達，上調Smad7 mRNA 和蛋白表達，以鹿紅方中、高劑量組效果最明顯。本實驗結果提示，鹿紅方對心肌纖維化具有良好的抑制作用，其機制可能與調控TGF-β1/Smads 通路有關，可為中醫藥防治心肌纖維化研究提供實驗依據。