分子藥物敏感性試驗(yàn)對(duì)復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者化療的指導(dǎo)及效果分析

劉輊彬 吳敏 吳小翠 韓敏 張青 沙巍

我國(guó)結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻[1]，復(fù)治肺結(jié)核耐藥率遠(yuǎn)高于初治肺結(jié)核[2-3]，從復(fù)治肺結(jié)核患者中快速檢出耐藥結(jié)核分枝桿菌，指導(dǎo)臨床選擇有效的抗結(jié)核藥物，制定合理的化療方案，是治療復(fù)治及耐藥結(jié)核病的關(guān)鍵[4]。目前，臨床廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)表型藥物敏感性試驗(yàn)(drug susceptibility testing，DST)耗時(shí)較長(zhǎng)，不能為臨床提供時(shí)效性檢測(cè)結(jié)果[5-6]；分子DST在1～2 d內(nèi)即可報(bào)告結(jié)果，越來越受到重視。本研究采用PCR-反向點(diǎn)雜交法進(jìn)行分子DST檢測(cè)，通過前瞻性隨機(jī)對(duì)照的方法，探討分子DST對(duì)復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者化療的指導(dǎo)及效果。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

收集2016年3月至2020年1月上海市肺科醫(yī)院診治的400例復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，包括初治失敗、規(guī)則用藥滿療程后痰菌復(fù)陽、不規(guī)律化療超過1個(gè)月及慢性排菌的患者；排除就診前已接受耐多藥方案治療的患者，以及惡性腫瘤、HIV感染或艾滋病、長(zhǎng)期使用激素或免疫抑制劑、妊娠或哺乳期的患者。本研究通過本院倫理審查委員會(huì)的審批，所有患者均簽署知情同意書。

所有患者均定期于我院住院或門診隨訪，收集每例患者的痰液或支氣管肺泡灌洗液，每份標(biāo)本量不少于3 ml，經(jīng)涂片熒光染色鏡檢，收集抗酸桿菌陽性標(biāo)本共400份。所有標(biāo)本均行分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性且鑒定為MTB的分離株采用微孔板法進(jìn)行表型DST，按就診時(shí)間順序依隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)其中200例患者的同一份標(biāo)本采用PCR-反向點(diǎn)雜交法進(jìn)行分子DST。行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者與未行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者性別、年齡及復(fù)治類型的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，見表1。

表1 不同臨床特征在行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者與未行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者中的分布情況

二、研究方法

1.微孔板法DST：將涂片陽性標(biāo)本經(jīng)N-乙酰左旋半胱氨酸-氫氧化鈉消化液處理15 min，加入磷酸鹽緩沖液至40 ml，4 ℃ 3000×g離心20 min，棄上清液，沉淀加入2 ml 磷酸鹽緩沖液振蕩重懸。取0.5 ml上述重懸液，按《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[7]進(jìn)行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌株應(yīng)用對(duì)硝基苯甲酸、噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定，鑒定為MTB的分離株采用美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)的分枝桿菌藥敏檢測(cè)板Sensititre?MYCOTB進(jìn)行表型DST檢測(cè)，具體操作方法按照說明書進(jìn)行，其中，異煙肼(H)和利福平(R)耐藥濃度分別為0.2 μg/ml和1 μg/ml。

2.PCR-反向點(diǎn)雜交法DST：取1 ml上述重懸液，應(yīng)用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司的MTB耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)檢測(cè)H耐藥相關(guān)基因katG的315位點(diǎn)和inhA的-15位點(diǎn)以及R耐藥相關(guān)基因rpoB的516、526、531位點(diǎn)，具體操作方法及結(jié)果判讀按照說明書進(jìn)行，對(duì)陰性或無法判讀結(jié)果者采用PCR-反向點(diǎn)雜交法進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。

三、治療方案

培養(yǎng)或PCR-反向點(diǎn)雜交法鑒定為非結(jié)核分枝桿菌的患者按NTM肺病治療，其他患者治療方案如下：微孔板法結(jié)果回報(bào)前，PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)為H和(或)R耐藥的患者予H和(或)R耐藥化療方案，其余患者予H、R敏感復(fù)治化療方案；微孔板法結(jié)果回報(bào)后，以微孔板法結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整化療方案。化療方案的制定原則符合WHO和中國(guó)防癆協(xié)會(huì)制定的相關(guān)指南[3,8]。

四、 近期療效觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)

化療方案中未調(diào)整H和(或)R的患者，于治療前、微孔板法結(jié)果回報(bào)時(shí)及治療3、6、9、12個(gè)月末，行痰抗酸桿菌涂片及分枝桿菌培養(yǎng)；化療方案中調(diào)整H和(或)R的患者，于治療前、微孔板法結(jié)果回報(bào)時(shí)及根據(jù)微孔板法結(jié)果調(diào)整化療方案后3、6、9、12個(gè)月末，行痰抗酸桿菌涂片及分枝桿菌培養(yǎng)。以痰菌陰轉(zhuǎn)率為評(píng)價(jià)近期療效的主要指標(biāo)，按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)《臨床診療指南結(jié)核病分冊(cè)》[9]制訂的標(biāo)準(zhǔn)，痰菌陰轉(zhuǎn)指連續(xù)2次痰涂片或培養(yǎng)陰性(至少間隔30 d)，且不再?gòu)?fù)陽。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、微孔板法確診的利福平耐藥結(jié)核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)患者的臨床特征

微孔板法共確診RR-TB患者114例，58例行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者與56例未行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者治療前及本次治療的各項(xiàng)臨床特征的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 不同臨床特征在微孔板法確診的利福平耐藥結(jié)核病患者中的分布情況

二、微孔板法結(jié)果回報(bào)時(shí)RR-TB患者中行PCR-反向點(diǎn)雜交法與未行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者的痰涂片抗酸桿菌情況比較

微孔板法結(jié)果回報(bào)時(shí)，RR-TB患者中行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者與未行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者的痰涂片抗酸桿菌陰轉(zhuǎn)率分別為18.9%(10/53)和5.9%(3/51)，前者高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩者痰涂片陽性標(biāo)本抗酸桿菌分級(jí)計(jì)數(shù)分布存在差異，行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者痰標(biāo)本荷菌量更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 微孔板法結(jié)果回報(bào)時(shí)利福平耐藥結(jié)核病患者的痰涂片抗酸桿菌鏡檢情況比較

三、應(yīng)用利福平耐藥方案治療后RR-TB患者中行PCR-反向點(diǎn)雜交法與未行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者的痰菌陰轉(zhuǎn)率比較

部分患者在部分時(shí)段中斷治療或因咳痰癥狀緩解導(dǎo)致無痰或無法獲得合格痰標(biāo)本，能夠留取合格痰標(biāo)本進(jìn)行痰檢的RR-TB患者在應(yīng)用利福平耐藥方案治療后的不同時(shí)間點(diǎn)痰涂片或培養(yǎng)的陰轉(zhuǎn)情況見表4。結(jié)果顯示，行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者與未行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者在應(yīng)用利福平耐藥方案治療3、6、9、12個(gè)月末痰菌陰轉(zhuǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 應(yīng)用利福平耐藥方案治療后的不同時(shí)間點(diǎn)利福平耐藥結(jié)核病患者痰菌陰轉(zhuǎn)率的比較

討 論

結(jié)核病患者體內(nèi)通常敏感菌和耐藥菌并存，只是所占比例不同[10]，一般初治患者敏感菌比例高于耐藥菌，部分患者因各種原因由初治轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)治時(shí)，隨著敏感菌株被逐漸殺滅，耐藥菌株逐漸占優(yōu)勢(shì)，因此成為耐藥結(jié)核病高危人群。耐藥結(jié)核病發(fā)現(xiàn)的延遲和不精準(zhǔn)的復(fù)治化療方案，不僅不利于復(fù)治結(jié)核病患者自身的早日康復(fù)，還可能導(dǎo)致患者對(duì)更多抗結(jié)核藥物發(fā)生耐藥以及耐藥MTB的進(jìn)一步傳播[11]。近年來分子DST檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展有助于解決上述問題。

Jeon等[12]報(bào)道了分子DST對(duì)耐多藥結(jié)核病治療起始時(shí)間的影響，研究發(fā)現(xiàn)復(fù)治、GeneXpert MTB/RIF和分子線性探針檢測(cè)是耐多藥結(jié)核病起始治療時(shí)間的獨(dú)立影響因素，復(fù)治結(jié)核病將推遲耐多藥結(jié)核病起始治療時(shí)間，而分子DST可使起始治療時(shí)間提前。本研究顯示，微孔板法確診的RR-TB患者中，行PCR-反向點(diǎn)雜交法的患者在微孔板法結(jié)果回報(bào)時(shí)，痰涂片抗酸桿菌陰轉(zhuǎn)率明顯上升，痰涂片陽性標(biāo)本荷菌量明顯下降，提示行PCR-反向點(diǎn)雜交法的患者能在時(shí)間上更早獲得痰菌情況的改善，原因是PCR-反向點(diǎn)雜交法能更快發(fā)現(xiàn)耐藥，接受PCR-反向點(diǎn)雜交法指導(dǎo)制定化療方案的患者能更早啟動(dòng)耐藥治療方案。

本研究顯示，微孔板法確診的RR-TB患者中行PCR-反向點(diǎn)雜交法者與未行PCR-反向點(diǎn)雜交法患者在應(yīng)用利福平耐藥方案治療3、6、9、12個(gè)月末痰菌陰轉(zhuǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者近期療效無差別。埃塞俄比亞的一項(xiàng)研究評(píng)價(jià)了耐藥結(jié)核病患者中基于基因型的診斷算法對(duì)治療啟動(dòng)時(shí)間和治療結(jié)果的影響，研究發(fā)現(xiàn)GeneXpert MTB/RIF可通過快速診斷和治療啟動(dòng)明顯緩解耐藥肺結(jié)核的傳播，其次是分子線性探針，特別是在涂片陽性的患者中；但是就治療結(jié)果而言，與基于固體培養(yǎng)的DST相比，3種檢測(cè)方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。Shi等[14]報(bào)道，在中國(guó)江蘇和四川兩家醫(yī)院進(jìn)行的一項(xiàng)隊(duì)列研究顯示，與未行分子DST檢測(cè)的對(duì)照組相比，MTBDRsl/MTBDRplus法DST檢測(cè)組耐多藥結(jié)核病診斷時(shí)間明顯縮短，痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)時(shí)間更快，治療成功率更高。分子DST 指導(dǎo)的精準(zhǔn)治療可以提高耐藥結(jié)核病患者的治療成功率。

分子DST 指導(dǎo)的精準(zhǔn)治療不僅可以提高耐藥結(jié)核病患者的療效，還可以減少更多抗結(jié)核藥物發(fā)生耐藥及降低不良反應(yīng)發(fā)生率。Romanowski等[15]的研究顯示，與痰涂片及GeneXpert MTB/RIF相比，分子線性探針對(duì)異煙肼耐藥、利福平敏感結(jié)核病的準(zhǔn)確診斷和量身定制的治療使獲得性耐多藥結(jié)核病相對(duì)減少了近50%。另一項(xiàng)多中心開放隨機(jī)對(duì)照臨床研究在GeneXpert MTB/RIF 確診的RR-TB患者中通過快速培養(yǎng)獲得MTB分離株后，采用全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)吡嗪酰胺進(jìn)行耐藥性檢測(cè)從而優(yōu)化超短程化療方案，結(jié)果顯示，開始治療后的84 周內(nèi)病情持續(xù)好轉(zhuǎn)且無反復(fù)，痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)時(shí)間縮短，不良事件發(fā)生率下降[16]。

盡管分子DST以其快速、簡(jiǎn)便、高效的優(yōu)點(diǎn)可以在耐藥結(jié)核病的早期診斷和化療方案的合理制定方面發(fā)揮重要作用，但是也要充分認(rèn)識(shí)到不同抗結(jié)核藥物的分子DST可靠性不同，且不同分子DST檢測(cè)方法的敏感度和特異度也存在差異[17]。PCR-反向點(diǎn)雜交法是將高敏感度的PCR技術(shù)和高通量的反向點(diǎn)雜交技術(shù)相結(jié)合的基因檢測(cè)技術(shù)，已有研究報(bào)道該方法對(duì)復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者的臨床標(biāo)本中MTB的H、R耐藥性具有較好的檢測(cè)效能[18]。但本研究中，PCR-反向點(diǎn)雜交法對(duì)微孔板法確診的單耐H結(jié)核病的敏感度較低，故本研究未對(duì)微孔板法確診的單耐H肺結(jié)核患者的療效進(jìn)行分析。因此，目前在分子DST和表型DST均無法滿足臨床既要保證較高敏感度又要兼顧時(shí)效性的實(shí)際需求的情況下，建議聯(lián)合檢測(cè)以保障耐藥結(jié)核病高危人群獲得更大的收益。

本研究的局限在于PCR-反向點(diǎn)雜交法敏感度不夠高且存在假陽性現(xiàn)象，未對(duì)肺部影像學(xué)變化及遠(yuǎn)期療效進(jìn)行觀察及評(píng)價(jià)。未來將選擇敏感度和特異度更高的分子生物學(xué)方法或多種分子生物學(xué)方法聯(lián)合檢測(cè)；另外，要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，觀察及評(píng)價(jià)肺部影像學(xué)變化和遠(yuǎn)期療效；開展其他抗結(jié)核藥物特別是二線核心藥物的分子DST檢測(cè)。