規范合理使用分子生物學檢測技術以早期精準診斷結核病

沙巍

世界衛生組織(WHO)2020年全球結核病報告顯示，中國新發結核病患者數約83.3萬，約占全球8.4%，居全球第三位，其中，僅47%通過病原學證實，低于全世界57%的檢出率[1]。早期診斷、早期干預是切斷結核病傳播的最重要的手段之一，近年來隨著分子生物學技術的發展，用于結核病早期診斷的快速檢測技術紛紛涌現。2013年WHO修訂了結核病的診斷標準，推薦將GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)和TB-LAMP技術陽性檢出結果視同于細菌學檢測陽性，作為病原學陽性結核病的診斷依據[2]；我國也將分子生物學檢測作為結核病病原學檢查的手段之一寫入了《WS 288—2017 肺結核診斷》中[3]。根據分子生物學檢測的技術原理，目前國際和國內較為成熟的檢測方法和產品包括：采用實時熒光定量PCR法的Xpert，采用恒溫擴增的LAMP和SAT，采用探針雜交的Hain和微陣列芯片技術，采用熔解曲線的MeltPro TB以及對DNA或RNA擴增后測序法的宏基因組檢測等。這些分子生物學檢測技術在醫院、疾病預防控制機構、體檢機構和其他生物檢測機構中廣泛開展，形形色色的產品讓臨床醫生的可選擇范圍大大增加，在處理疑難病例時更為得心應手。然而，技術的進步也帶來了困惑，在眾多的檢測技術中應該如何針對不同患者選擇診斷效能高、成本效益佳的單項技術檢測或者多項技術聯合檢測，是目前亟待解決的問題。針對此問題，筆者提出以下建議。

一、知曉各種分子生物學檢測技術的檢測原理和過程

分子生物學檢測技術用于感染性疾病的診斷自20世紀初開始逐漸推廣應用于臨床，自單基因到多基因檢測，直至目前的多組學、高通量技術的應用，為疑難、危重感染性疾病的快速診斷和患者救治提供了強有力的支撐。病原微生物在進化的過程中，同種微生物的某些種特異性的基因序列高度保守，通過PCR技術對這些序列進行擴增，并采用不同的方法對產物進行檢測即可診斷待檢樣本中是否含有目標病原菌。此外，對于藥物作用靶位點的基因突變的檢測，可用于細菌耐藥性的預判，是現今分子藥敏檢測技術快速發展的理論基礎[4-6]。

結核病的分子檢測的靶標主要有16SrRNA、16SrRNA和23SrRNA間的間隔區ITS、插入序列IS6110，以及hsp65、gryB和rpoB基因等[7-9]。WHO推薦的結核病及其耐藥性的快速檢測技術包括環介導等溫擴增技術(LAMP)、Xpert、線性探針等，我國也批準了包括核酸恒溫擴增、探針熔解曲線及基因芯片技術等自主研發的產品。這些技術或檢測的靶標不同，或檢測的技術不同，或針對的樣本不同，熟悉這些技術的檢測原理，知曉其反應的過程，包括核酸擴增的方法、靶序列的獲取、信標的產生和讀取等，均有助于我們對于分子生物學檢測的結果進行解讀。

Xpert技術是目前應用最廣泛的結核病分子生物學檢測技術之一。其采用的GeneXpert檢測平臺，半巢式PCR擴增rpoB基因的192 bp長度的結核分枝桿菌復合群的特異性序列，其中包含了81 bp的利福平耐藥決定區域(RRDR)序列。該區域用5個分子信標(探針A到E)進行探測，探針為寡核苷酸，兩端分別標記報告熒光基團和淬滅熒光基團。這五條探針使用了不同的染料和淬滅劑進行標記；探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，與模板DNA互補配對的探針被切斷，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離產生熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。由于在PCR擴增的指數時期，模板的循環閾值(Ct值)和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。當5個探針中至少2個探針陽性才表明結核分枝桿菌檢測陽性，可進一步根據Ct值進行半定量分析，Ct值≤16為高荷菌量，Ct值16～22為中荷菌量，Ct值22～28為低荷菌量，Ct值>28為極低荷菌量。如果RRDR存在突變，抑制了與一個或多個rpoB特異性分子信標的雜交，減少或消除了相應探針的信號，熒光信號會減弱或消失。了解了Xpert的操作原理，臨床醫生在解讀報告的時候就會了解不同陽性程度分級的原因及判斷是否耐藥的信號原理，有助于分析一旦出現臨床診斷、表型藥敏檢測和基因型檢測結果不一致時可能的原因。

除了以Xpert為典型代表的熒光定量PCR技術外，LAMP和實時熒光核酸恒溫擴增(SAT)技術是在恒定溫度的情形采用特定的方法對靶標進行擴增，前者針對gyrB和IS6110基因，后者針對16SRNA。線性探針和基因芯片則是通過特殊標記的探針與特異擴增的靶序列雜交形成雙鏈分子來檢測序列的變化，例如GenoType MTBDR等。宏基因組高通量測序技術(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)通過對臨床樣本的DNA或RNA進行鳥槍法測序，可以同時檢測多種病原微生物。

二、掌握不同分子生物學檢測技術的診斷效能

任何一種臨床檢測試劑或方法，在上市之前都要經過嚴格的臨床試驗，對其診斷效能進行評價，獲批進入臨床應用后也會面臨大量樣本的檢驗。臨床應用者應關注其診斷效能的各項指標，了解其應用于不同患者、不同樣本和不同情形下的敏感度、特異度和準確性。

系統綜述的結果顯示，Xpert在所有肺結核患者中檢測的敏感度和特異度分別為85%和98%，其中，對痰涂片陰性肺結核檢測的敏感度和特異度分別為67%和98%；對于肺外標本，包括腦脊液、淋巴結組織、胸腔積液等檢測的敏感度和特異度以培養結果為參照標準分別為：70%和97%、89%和86%、50%和99%；以臨床診斷為參照標準分別為：41%和99%，81%和90%，19%和99%。對于所有肺結核患者利福平耐藥檢測的敏感度和特異度分別為96%和98%[10]。

LAMP的檢測效能較Xpert略遜。一項對應用TB-LAMP檢測呼吸道樣本效能的系統綜述結果顯示，其檢測敏感度約為89.6%，特異度為94%[11]。對肺外結核樣本的檢測結果顯示，以臨床診斷為參照標準，其檢測敏感度為77%，特異度為99%；以培養結果為參照標準，其檢測敏感度為93%，特異度為77%[12]。

mNGS在結核病，尤其是疑難和重癥結核病、肺外結核的診斷中也發揮了一定的作用，在有限的臨床研究中均顯示了較好的數據。一項前瞻性的小樣本臨床研究結果顯示，mNGS對所有活動性結核病檢測的敏感度為44%，與Xpert相似(42%)，但遠高于常規方法(29%)[13]。

從這些文獻資料可見，與傳統的檢測方法相比，分子生物學檢測方法的檢測效能大為提高，檢測準確性也有保障。當然，數據也顯示，目前沒有一種技術可以全覆蓋、百分之百準確地檢測出所有的病原，無論是臨床研究的結果還是真實世界的數據所提供的各種效能參數，都是臨床醫生為特定的患者選擇適合的檢查手段用于診斷疾病的參考依據，也是分析解讀檢測結果與患者臨床表現的相符程度所需要的經驗依據。

三、了解分子生物學檢測技術的優缺點及導致假陽性和假陰性的原因

分子生物學檢測的基礎是對微生物的核酸進行特異性的體外擴增和特異性的比對檢測，因此，具有所需樣本量少、精確度高、所需時間短及不依賴于培養等優點。但是，分子生物學檢測也存在所需技術要求高、操作不當和實驗室污染會造成假陽性和假陰性結果、寄殖的正常菌群及死亡的病原體的DNA也同樣可被復制等問題。這些問題會對分子生物學檢測的結果造成干擾，并且其結果也不能用于疾病治療效果的評定。

對于結核分枝桿菌檢測的各種分子生物學檢測方法中，Xpert的正確率高，操作簡單，全程自動化設計，最大程度減少了實驗室工作人員的工作量，更符合生物安全的需求；但是其對儀器設備的要求高，價格較昂貴。LAMP的優點在于對實驗室儀器的依賴程度較小，而且試劑成本較低，在基層實驗室具有一定的使用價值，但是高溫、濕度、試劑量不足和樣品之間的交叉污染都會導致其檢測出現假陽性結果。SAT的優點在于以RNA為靶標，檢測的陽性結果等同于結核分枝桿菌活菌的存在，但是RNA易降解，且其技術操作較為復雜。mNGS雖然可涵蓋絕大多數的微生物的檢測，但是其需特殊的儀器，檢測價格昂貴，對于基因文庫的要求較高，且對于真菌和分枝桿菌等厚壁細菌需要破壁前處理，否則就會影響到這些細菌的檢測陽性率。

此外，雖然對于分子生物學檢測技術從理論上說如果樣本中存在一個目標微生物的靶基因序列就可以擴增并進行檢測，然而在實踐中任何一種分子生物學檢測技術都有其最低檢測限。例如，Xpert的最低檢測限為131 CFU/ml[14]，其他分子生物學檢測技術為101～103CFU/ml[15]。此外，由于分子生物學技術檢測的是核苷酸序列，如果結核分枝桿菌的耐藥是由于靶序列外的突變導致或者是氨基酸的“無義突變”，也會導致結果的誤判。例如，多項研究發現Xpert的局限性包括：(1)無法檢測出利福平的異質性耐藥；(2)對于C533G的突變位點的檢出率不高；(3)在菌量較少的情況下，探針D和E在實時定量PCR的反應過程中產生信號的延緩會導致耐藥的假陽性結果；(4)錯誤地將rpoB的F514F的沉默突變檢測為利福平耐藥[9]。

四、熟讀國家結核病控制規劃要求和國內外相關指南

2017年發布的《“十三五”全國結核病防治規劃》明確提出了規劃目標：2020年我國的肺結核發病和死亡人數進一步減少，全國肺結核發病率下降到58/10萬以下。也提出了具體的指標，如肺結核患者病原學陽性率達到50%以上，耐多藥肺結核高危人群耐藥篩查率達到95%以上。《中國結核病預防控制工作技術規范(2020年版)》也建議對所有痰涂片陰性的疑似結核病患者都要進行分子生物學檢測，對于病原學陽性的患者要進行耐藥篩查，優先采用分子藥敏檢測技術，如對利福平耐藥，則需進行異煙肼和二線抗結核藥物的耐藥性檢測。WHO和我國的相關指南對于診斷結核病和診斷耐藥性的各項技術的規范使用也進行了推薦[16-17]。對于已在臨床開始使用但是在結核病研究領域尚未有研究或者實踐數據的新技術，尤其是高通量的技術，則需要對這些規范有充分的了解。例如，《高通量宏基因組測序技術檢測病原微生物的臨床應用規范化專家共識》[18]的建議：對于危急重癥、疑難感染、群體性感染事件等，可考慮作為一線檢測方法；傳統檢驗方法未能給出明確病原學結果從而影響患者準確診療的感染性疾病、新發突發傳染病、驗證常規檢驗結果或排除其他發熱疾病；推薦臨床通過擬診先行傳統微生物檢驗及PCR檢測擬診疑似常見病原微生物，不盲目使用mNGS技術。

2020年我國已基本完成《“十三五”全國結核病防治規劃》的目標[19]，2021年是“十四五”開局第一年，距離實現聯合國“2030年可持續發展議程”結核病控制目標和“2035年終止結核病流行”目標只剩下10年和15年的時間，廣大的結核病防治戰線的同仁們在積極防控新型冠狀病毒肺炎疫情的同時也仍舊奮戰在抗結核戰役的第一線。分子生物學檢測技術是我們戰勝結核病的強有力的武器，需要因地施策和規范應用才能切實發揮功效[20]，為降低患者疾病負擔，不應盲目尋求新方法、撒網式檢查。還要注意的是，在使用先進的診斷技術時，不能忽略經典的結核病微生物學檢查，需要將兩者緊密結合，取長補短。