含分子生物學檢測技術診斷流程在肺結核患者發現中的應用情況

馬建軍 張鐵娟 侯偉 潘艷 劉昕

目前，分子生物學檢測是診斷結核病快速、有效的新診斷技術，具有特異度強、敏感度高、操作簡便、省時高效等諸多優勢。但一直以來，吉林省患者發現主要依靠痰涂片、痰培養和傳統藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)等傳統診斷技術。直至“中國國家衛生和計劃生育委員會-比爾及梅琳達·蓋茨基金會結核病防治合作項目”第三期(簡稱“中蓋項目三期”)在吉林省實施后，分子生物學檢測作為新診斷技術得以在全省范圍內廣泛推廣，患者發現成效顯著。本研究通過分析吉林省全面應用分子生物學診斷流程對患者發現的實施效果，為進一步優化結核病防控措施提供參考依據。

資料和方法

一、 研究對象

由經過培訓的調查員收集吉林省所有結核病定點醫療機構2019年登記的疑似和確診的活動性肺結核患者作為研究對象，進行回顧性調查。其中，疑似肺結核患者被納入分子生物學診斷流程，確診的活動性肺結核患者登記為當年新發患者。

二、 研究方法

1.調查方法：在調查前由省級結核病防治機構培訓各地調查員，一家定點醫療機構至少2名調查員。調查資料來源于定點醫療機構的門診日志、病案和實驗室檢測數據等，并在完成調查后進行二次復核，以確保資料數據的準確性，繼而由省級結核病防治機構匯總并分析。

2.診斷標準：依據《WS 288—2017肺結核診斷》[1]標準，對所有疑似肺結核患者的臨床癥狀、實驗室檢查結果、影像學檢查結果等作出綜合判斷。

3.項目實施前后分子生物學檢測能力情況：2006年，借助中國全球基金結核病項目，吉林省僅4家地市級實驗室(共計9家)和29家(48.3%)縣(區)級實驗室(共計60家)具備開展分子生物學檢測的能力，配備了GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)檢測設備。但由于Xpert檢測試劑價格較昂貴，各地區在中蓋項目三期實施前并沒有充足的經費來支持采購試劑，不能惠及更多患者[2]。項目實施后，吉林省于2017年投入了810萬元采購分子生物學設備和試劑，截至當年年底，全省所有地市及所轄縣(區)實驗室全部配備分子生物學診斷設備和試劑，包括交叉引物恒溫擴增檢測技術(cross priming amplification，CPA)、環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、Xpert、熒光PCR熔解曲線檢測技術(fluorescence PCR melting curve)、線性探針技術(Hain)等。

4.含分子生物學檢測技術的診斷流程：按照中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心制定的診斷流程方案，吉林省應用兩套分子生物學檢測技術及診斷流程。(1)CPA/LAMP診斷流程：縣(區)級結核病定點醫療機構采用CPA或LAMP設備檢測結核分枝桿菌，地市級結核病定點醫療機構采用熒光PCR熔解曲線檢測技術或線性探針技術(Hain)檢測耐藥基因。(2)Xpert診斷流程：縣(區)級結核病定點醫療機構采用Xpert檢測結核分枝桿菌和耐藥基因。兩套診斷技術的適用地區無重復。同時，按照診斷流程要求，初治患者行耐藥分子生物學檢測時，利福平耐藥者需全部進行重復耐藥分子生物學檢測。隨著設備、試劑及人員、培訓的陸續到位，各地按照診斷流程逐步落實檢測工作，全省實驗室檢測能力及水平逐漸提高，2019年病原學陽性患者比例及耐藥患者發現達到最高水平[2]，故本研究以該年度數據為例進行分析。

三、統計學處理

采用Excel 2010軟件整理2019年吉林省分子生物學檢測設備配備及肺結核患者發現情況，并進行描述性分析。其中，病原學陽性包括涂陽、僅分子生物學檢測陽性，以及僅培養陽性。

結 果

一、 吉林省各縣(區)分子生物學檢測設備配備情況

中蓋項目三期實施后，吉林省5個地市的26個縣(市、區)級實驗室分別配備24臺CPA檢測儀和2臺LAMP檢測儀，5個地市級實驗室配備了4臺熔解曲線檢測儀和1臺Hain檢測儀，4個地市的34個縣(市、區)和4個地市級實驗室共計配備38臺Xpert檢測儀，見表1。

表1 吉林省不同地區結核病分子生物學檢測設備配備情況

二、 吉林省采用分子生物學診斷流程地區結核病病原學檢測情況

55 983例可疑肺結核癥狀者經分子生物學檢測流程，共計檢出疑似活動性肺結核患者10 278例(18.36%)，其中，涂陽3895例、涂陰6383例；兩套流程地區接受分子生物學技術檢測的比例為98.35%(8885/9034)，結核分枝桿菌檢出率為54.25%(4820/8885)；其中，涂陰患者檢測比例和結核分枝桿菌檢出率分別為97.67%(6234/6383)和35.15%(2191/6234)；培養陽性13例。共計檢出病原學陽性患者6099例，陽性率為59.34%(6099/10 278)。

1.CPA/LAMP診斷流程地區：收集到18 044例縣級地區肺結核可疑癥狀者，其中，行抗酸桿菌痰涂片鏡檢和胸部X線攝片檢查者18 042例(99.99%，18 042/18 044)，檢出疑似活動性肺結核患者4073例。將其中的1244例(6.90%，1244/18 042)涂陽患者痰標本送至地市級結核病定點醫療機構行分子生物學快速耐藥檢測；而2829例(15.68%，2829/18 042)涂陰患者中，有2680例(94.73%，2680/2829)行結核分枝桿菌CPA/LAMP檢測，陽性率為36.42%(976/2680)。行痰培養的149例患者中，13例(8.72%，13/149)為陽性。見圖1。

圖1 2019年吉林省行CPA/LAMP診斷流程地區肺結核檢測情況

2.Xpert診斷流程地區：收集到縣級地區肺結核可疑癥狀者37 939例，其中，行抗酸桿菌痰涂片鏡檢和胸部X線攝片檢查者37 919例(99.95%)，檢出疑似活動性肺結核患者6205例。對其中的2651例(69.91%)涂陽患者和3554例(9.37%)涂陰患者均開展Xpert檢測，結核分枝桿菌檢出率分別為99.17%(2629/2651)和34.19%(1215/3554)。見圖2。

圖2 2019年吉林省Xpert診斷流程地區肺結核檢測情況

三、利福平耐藥及耐多藥結核病患者發現情況

2019年，吉林省6099例病原學陽性肺結核患者全部接受分子生物學快速耐藥檢測，檢出利福平耐藥患者1038例，檢出率為17.02%；其中，初、復治利福平耐藥患者分別占57.23%(594/1038)和42.77%(444/1038)，檢出率分別為11.37%(594/5222)和50.63%(444/877)。初治利福平耐藥陽性結果一致率為68.51%(594/867)，其中行CPA/LAMP診斷流程地區的初治患者中，利福平耐藥496例，經重復耐藥分子生物學檢測，最后判定利福平耐藥311例，重復結果的一致率為62.70%(311/496)；行Xpert診斷流程地區的初治患者中，利福平耐藥371例，重復耐藥檢測后檢出利福平耐藥283例，重復結果的一致率為76.28%(283/371)。檢出耐多藥患者395例，檢出率為6.48%；其中，初、復治耐多藥患者分別占52.91%(209/395)和47.09%(186/395)，耐多藥檢出率分別為4.00%(209/5222)和21.21%(186/877)。具體見表2。

表2 2019年吉林省病原學陽性肺結核患者利福平耐藥和耐多藥檢出情況

討 論

一、應用分子生物學診斷技術的背景

我國2015—2017年肺結核患者病原學陽性率約為30%[3-5]，明顯低于同期全球平均水平(分別為57%、57%和56%)[6]。影響肺結核病原學陽性率的因素較多，包括分子生物學診斷技術的應用、痰標本的質量、實驗室操作水平等[7]。隨著分子生物學診斷技術日益成熟，世界衛生組織和我國分別在2013年和2017年將分子生物學檢測陽性作為新的肺結核診斷標準[1，8]?；诖?，國家建議各地區因地制宜地推廣分子生物學檢測技術，推薦縣級結核病防治機構選擇CPA、LAMP和Xpert等方法中的1種或多種，地市級結核病防治機構至少應用1種耐藥分子生物學檢測技術[9]。

中蓋項目三期是中國國家衛生健康委員會與比爾及梅琳達·蓋茨基金會聯合開展的結核病防治合作項目，推廣適宜的新診斷技術是其目標之一。中蓋項目三期實施后，吉林省出臺了籌資與支付改革、分級診療等政策文件，各部門按照職責分工合作，統一招標采購，加強技術培訓和指導，簡化工作流程，全省所有地市及所轄縣(區)全部配備了分子生物學檢測設備和試劑。

二、新診斷技術診斷流程及推廣應用措施

近些年，全國各地結核病實驗室配備了多種耐藥檢測設備，考慮到同時使用會造成資源浪費和檢測結果不一致，中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心根據耐藥檢測技術制定了耐藥診斷流程[10]。按照國家方案的要求，吉林省選擇了CPA/LAMP和Xpert兩種新診斷技術流程。其中，5個地市26個縣(市、區)采用CPA/LAMP診斷流程，4個地市34個縣(市、區)采用Xpert診斷流程。

CPA診斷技術是實現恒溫下一次性完成結核分枝桿菌DNA的擴增和雜交過程，并利用免疫層析乳膠標記試紙條檢測技術對擴增產物進行定性檢測。LAMP診斷技術是針對靶序列的不同區域設計特異性引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下進行擴增反應[11]。Xpert診斷技術是針對rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區間設計引物、探針，檢測是否發生突變[11]。中蓋項目三期實施后，吉林省采用CPA/LAMP診斷流程的縣(市、區)結核病實驗室對所有涂陰患者的痰標本行CPA或LAMP檢測結核分枝桿菌，地市級結核病實驗室進行分子生物學耐藥檢測，如PCR熔解曲線或Hain技術。而采用Xpert診斷流程的縣(市、區)結核病實驗室則使用Xpert技術對疑似活動性肺結核患者直接進行結核分枝桿菌和耐藥檢測。兩種檢測流程均對第一次檢測為利福平耐藥的初治患者，再次進行分子生物學耐藥檢測，當兩次檢測結果均為利福平耐藥時才進行傳統藥敏試驗，而復治患者可直接進行傳統藥敏試驗。

中蓋項目三期實施后，全省所有地區全面推廣分子生物學檢測技術。2019年，兩套診斷流程地區的涂陰患者結核分枝桿菌檢出率均較高，分別為36.42%和34.19%；發現利福平耐藥患者1038例，利福平耐藥檢出率為17.02%；耐多藥患者395例，耐多藥檢出率為6.48%，高于2017年和2018年利福平耐藥檢出率(分別為9.52%和13.77%)[2]。筆者認為主要原因有二，一是多部門的有效合作和統一招標在短時間內迅速落實了經費和分子生物學設備和試劑的到位；二是多方位提高痰標本采集質量和檢測人員檢測能力，如專家現場指導和培訓、組織召開了多輪實驗室工作推進及診斷技術現場培訓會、全省發放留取痰樣本方法掛圖，以及加強臨床醫生相關培訓。

三、全面應用含分子生物學檢測技術診斷流程的成效

全面應用含分子生物學檢測技術的診斷流程后，吉林省病原學陽性率為59.34%，提前完成了《“十三五”全國結核病防治規劃》和中蓋項目三期病原學陽性率達到50%的目標。另外，吉林省涂陰患者在疑似活動性肺結核患者中的占比較高(62.10%，6383/10 278)，分子生物學檢測技術對涂陰患者結核分枝桿菌的檢出率為35.15%，與既往研究結果(28.57%～40.8%)[12-14]接近，表明分子生物學檢測技術對結核分枝桿菌的發現作用顯著，且僅分子生物學檢測陽性者在病原學陽性患者中的占比為35.92%(2191/6099)，進一步證明分子生物學技術在實驗室檢測中的重要性。

本調查顯示，病原學陽性肺結核患者接受分子生物學快速耐藥檢測比例為100.00%，提示對病原學陽性肺結核患者全面開展耐藥快速檢測是可行的。調查還發現，吉林省2019年病原學陽性患者中的利福平耐藥率為17.02%，耐多藥率為6.48%。其中，初、復治患者耐多藥率(分別為4.00%和21.21%)均低于我國同年初、復治患者耐多藥率(7.1%和23.0%)[15]；初治患者利福平耐藥率(11.37%)高于云南(3.3%)[16]，低于重慶市(25.4%)[17]；復治患者利福平耐藥率(50.63%)高于云南(13.6%)[16]、重慶(32.3%)[17]，以及國內6個省份的調查結果(36.6%)[18]。這提示，盡管吉林省初、復治肺結核患者利福平耐藥水平低于全國水平，但復治患者利福平耐藥率較高，且是初治患者利福平耐藥率的4.4倍，提示吉林省利福平耐藥防治形勢嚴峻。既往研究認為，復發和復治失敗的復治患者多為不規則和不合理用藥致藥物不良反應增加，患者服藥依從性降低，利于耐藥結核分枝桿菌繁殖[18]，因此，這類患者應作為重點干預人群，同時也應加強對初治患者的治療管理，避免其轉變為復治患者[16]。

吉林省利福平耐藥患者中初治患者占57.23%，盡管可能存在抗結核治療史不明的初治獲得性耐藥患者，但認為直接感染耐藥結核分枝桿菌的原發性初始耐藥仍可能是其比例較高的主要原因[19]，提示吉林省在結核病防控策略上應高度重視傳染源的控制，特別是耐藥結核分枝桿菌的傳播。此外，分子生物學檢測技術的廣泛應用也明顯縮短了耐藥結核病的診斷時間，從以往傳統藥敏試驗的2個月左右縮短至現在的1 d內[2]，進一步降低了耐藥結核分枝桿菌的傳播。另外，按照CPA/LAMP診斷流程的要求，分子生物學核酸檢測陰性者應不再進行培養檢測[2]，但為提高病原學陽性患者的比例，本研究在分子生物學試劑供應間隙期，對分子生物學檢測陰性的149例患者進行了痰培養，共檢出13例陽性患者。這提示可對分子生物學檢測陰性患者進一步行痰培養，以進一步提高病原學陽性率。對于經分子生物學檢測技術未檢測到結核分枝桿菌的31例涂陽患者，認為可能與檢測標本不一致或是該涂陽患者檢測前已開始治療有關。

綜上所述，吉林省全面應用含分子生物學技術的診斷流程成果顯著，明顯提高了肺結核患者病原學陽性率，大幅縮短了耐藥診斷時間，基本發現并掌握了全省的利福平耐藥水平。這些成效均與中蓋項目三期的政策支持、經費保障、設備配置、技術培訓和專家指導等軟硬件的建設措施密不可分。