免疫學檢測聯合痰涂片和痰培養檢測在活動性肺結核臨床診斷中的價值

田麗麗 楊新宇 代小偉 陳雙雙 趙琰楓 王嫩寒 張潔 易俊莉 任怡宣 陳昊 樊瑞芳 石偉先 武文清 黃春 丁北川

結核病主要通過呼吸道飛沫傳播，因此需要快速、簡便、準確的實驗室診斷方法指導臨床早期診斷，尤其是活動性肺結核的早期診治[1]。病原學檢查是診斷活動性肺結核的金標準，但有許多不足之處，不能滿足臨床需求，尤其是近年來菌陰肺結核患者比例顯著增加[2]，給結核病診治帶來更大困難[3-6]。隨著檢測手段的發展，結核抗體檢測、結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)等快速檢測技術逐漸應用于臨床，尤其T-SPOT.TB對診斷結核分枝桿菌感染有較高的敏感度和特異度，已成為診斷結核病的重要輔助手段[1]，對菌陰肺結核的診斷也提供了很大幫助。本研究回顧性分析了2014年1月至2019年12月北京結核病控制研究所收治的715例疑似肺結核門診患者的資料，所有患者均行T-SPOT.TB、結核抗體、痰涂片、痰培養檢測，以臨床診斷結果為標準，分析4種方法單獨及聯合檢測活動性肺結核的臨床意義。

資料和方法

一、 一般資料

回顧性分析2014年1月至2019年12月北京結核病控制研究所門診收治的715例疑似肺結核患者，入院時均行T-SPOT.TB、結核抗體、痰涂片、痰培養檢測。以臨床診斷和實驗室診斷為標準[2，7]，明確診斷為活動性肺結核患者412例，為肺結核組；非結核病患者303例(其中經PCR確定為非結核分枝桿菌感染10例，肺部陰影待查268例，塵肺1例，肺炎8例，肺癌2例，慢性咽炎14例)，為非結核組。412例肺結核患者中，菌陽肺結核194例，菌陰肺結核218例；男性240例，女性172例；年齡13～95歲，中位年齡30(24，47)歲。所有患者均排除人類免疫缺陷病毒感染者。

二、檢測方法

1.T-SPOT.TB檢測：采用T-SPOT.TB(Oxford Immunotec公司，英國)試劑盒，從外周靜脈血中分離出單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在每個預包被抗γ-干擾素抗體的孔中加入2.5×105個PBMC，分別與早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)共同孵育16～20 h，使用酶聯免疫斑點(ELISPOT)讀板儀對斑點進行計數。陽性判定標準：(1)如果空白對照孔斑點數<6個，檢測孔斑點數減去空白對照孔斑點數>6；(2)如果空白對照孔斑點數≥6個，檢測孔斑點數必須>2倍的空白對照孔斑點數。反之，為陰性結果。陰性或陽性對照異常，試驗均視為無效[8]。

2.結核抗體檢測：結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)(MP Diagnostics ASSURE?TB Rapid Test)購自MP生物醫學亞太私人有限公司(MP Biomedicals Asia Pacific)。取患者血清25 μl至檢測孔內，加3滴緩沖液于橢圓孔，直至樣本前沿到達藍色指示線即刻拉下分離片，加1滴緩沖液于加樣孔，水平放置，15 min內判讀結果。結果判讀標準：(1)如果在測試線處(T)和質控線處(C)出現紫紅色條帶，則結核分枝桿菌抗體為陽性，任何深度條帶均應判作陽性；(2)如果視窗內僅質控線處(C)顯示紫紅色條帶，則結核分枝桿菌抗體陰性；(3)如果質控線處(C)條帶未顯示，則結果無效。

3.痰涂片、痰培養：萋-尼抗酸染色液、酸性羅氏培養基由珠海貝索生物技術有限公司提供。痰涂片抗酸染色鏡檢采用萋-尼染色，按照《結核病實驗室檢驗規程》[9](簡稱《規程》)進行抗酸桿菌痰涂片鏡檢；分枝桿菌固體培養采用簡單法，按照《規程》進行分枝桿菌分離培養檢查。

三、質量控制

T-SPOT.TB檢測試劑盒按照試劑盒內提供的陽性對照和陰性對照，與樣品同時檢測，確保實驗結果的準確性；結核抗體檢測根據檢測反應板質控線條帶顯示判斷，嚴格按照試劑盒檢測規程以保證檢測準確性；痰涂片與痰培養質量控制按照《規程》要求，進行抗酸桿菌痰涂片鏡檢及分枝桿菌培養的室內質量控制及室間質量評價。

四、統計學處理

采用SPSS 17.0軟件對數據進行處理。計數資料采用“百分率(%)”描述，組間差異的比較采用卡方檢驗；兩變量間相關性以Spearman 法進行相關分析。采用診斷性試驗比較T-SPOT.TB檢測與其他方法對活動性肺結核的診斷價值，繪制受試者工作特征曲線(ROC)，計算ROC下面積(AUC)。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、4種檢測方法在肺結核組與非結核組中陽性檢出率的比較

412例肺結核患者中，T-SPOT.TB檢測陽性345例，陽性檢出率為83.7%；303例非結核組患者中， T-SPOT.TB檢測陽性63例，陽性檢出率為20.8%，差異有統計學意義(χ2=2.823，P=0.000)。肺結核組結核抗體檢測陽性184例，陽性檢出率為44.7%；非結核組結核抗體檢測陽性90例，陽性檢出率為29.7%，差異有統計學意義(χ2=16.526，P=0.000)。活動性肺結核患者痰涂片檢測陽性81例，陽性檢出率為19.7%；非結核組痰涂片檢測陽性3例，陽性檢出率為1.0%；差異有統計學意義(χ2=56.912，P=0.000)?；顒有苑谓Y核患者痰培養陽性191例，陽性率為46.4%；非結核組痰培養陽性10例，陽性率為3.3%，差異有統計學意義(χ2=1.602，P=0.000)。

二、4種方法對活動性肺結核的檢測效能

T-SPOT.TB檢測活動性肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度分別為83.7%、79.2%、84.6%、78.2%、81.8%；結核抗體檢測活動性肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度分別為44.7%、70.3%、67.2%、48.3%、55.5%；痰涂片檢測活動性肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度分別為19.7%、99.0%、96.4%、47.5%、53.3%；痰培養檢測活動性肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度分別為46.4%、96.7%、95.0%、57.0%、67.7%。見表1。

表1 以臨床診斷為標準4種檢測方法對活動性肺結核的檢測效能

三、聯合檢測對活動性肺結核的檢測效能

T-SPOT.TB檢測聯合結核抗體、痰涂片及痰培養檢測的敏感度為93.7%，均高于4者單項檢測、2項(T-SPOT.TB+痰涂片、T-SPOT.TB+痰培養、痰涂片+痰培養、T-SPOT.TB+結核抗體、痰涂片+結核抗體、痰培養+結核抗體)聯合檢測和3項(T-SPOT.TB+痰涂片+痰培養)聯合檢測；4種方法聯合檢測陰性預測值最高，為85.6%。見表2。

表2 以臨床診斷為標準4種方法聯合檢測對活動性肺結核的檢測效能

四、4種檢測方法分別檢測及聯合檢測的AUC

T-SPOT.TB的AUC為0.815，結核抗體檢測的AUC為0.575，痰涂片的AUC為0.593，痰培養的AUC為0.715，四項聯合檢測的AUC為0.894。見圖1。

圖1 4種方法單獨及聯合檢測受試者工作特征曲線

續表1

討 論

結核病早期診治對于控制結核病病情及其傳播具有重要意義[4]。目前，T-SPOT.TB、結核抗體檢測聯合痰涂片、痰培養檢測為篩選活動性肺結核的常用且較有效的方法，其中，T-SPOT.TB為近些年發展起來的快速診斷結核病新技術，抗原ESAT-6和CFP-10為結核分枝桿菌特有的片段，因此能較好排除卡介苗接種、非結核分枝桿菌感染[10]。與痰涂片、痰培養、結核抗體檢測相比，T-SPOT.TB 檢測活動性肺結核具有更高的敏感度、特異度、準確度[11-13]。

國外γ-干擾素釋放試驗(IGRA)主要用于診斷結核分枝桿菌潛伏感染、監測結核分枝桿菌潛伏感染發展為活動性結核病[14]，而我國IGRA試驗主要用于活動性結核病的輔助診斷和鑒別。有報道細菌學方法檢測活動性肺結核的敏感度為49.75%，結核抗體檢測總體敏感度為56.6%，聯合檢測后敏感度為83.1%[15]。本研究顯示，痰涂片與痰培養聯合檢測活動性肺結核的敏感度為48.3%，結核抗體檢測總體敏感度為44.7%，四種方法聯合檢測的敏感度為93.7%；T-SPOT.TB 檢測活動性肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度分別為83.7%、79.2%、84.6%、78.2%、81.8%，略低于施瑞潔等[16]的報道；而痰涂片、結核抗體檢測活動性肺結核的敏感度略高于陳晶等[4]的研究，可能與所選患者例數及痰液性狀等因素有關。本研究顯示，4種檢測方法均對活動性肺結核有一定的診斷價值，其中T-SPOT.TB診斷活動性肺結核的效能最好。

本研究顯示，T-SPOT.TB檢測聯合結核抗體及傳統痰涂片、痰培養檢測效能最高，診斷敏感度為93.7%，特異度為50.8%，AUC為0.894。略高于陳晶等[4]報道的6種檢測方法聯合檢測的AUC(0.848)，說明T-SPOT.TB、結核抗體、痰涂片、痰培養聯合檢測對活動性肺結核有較高的診斷價值。T-SPOT.TB檢測有較高的敏感度，但單純采用T-SPOT.TB檢測的特異度評價也有一定局限性，本研究T-SPOT.TB檢測的特異度為79.2%，李曙光等[17]報道的肺癌患者T-SPOT.TB陽性率較高，可能因為腫瘤患者免疫力低下，易并發結核分枝桿菌潛伏感染等，此外，我國為結核感染高發國家，這些原因均可能導致T-SPOT.TB特異度較低，因此需要聯合檢測來提高診斷效能。

血清結核抗體檢測有操作簡單、檢測快速等優點，在結核病臨床輔助診斷應用較廣泛，但其溶血樣本和高脂血樣本可能受免疫功能影響，在疾病急性感染早期即出現陰性結果，因而結核抗體檢測活動性肺結核的敏感度、特異度不高，限制了疾病診斷與有效治療[12]。本研究結核抗體檢測的敏感度、特異度較國內外一些研究偏低[18-20]，可能主要是因為在試劑中抗原的選擇及優化上有區別。敏感度、特異度與黃德東等[21]研究結果相差不大。痰涂片、痰培養對活動性肺結核診斷的敏感度較低，尤其是痰涂片，敏感度為19.7%，痰培養為46.4%。代小偉等[22]研究顯示，痰涂片、痰培養的敏感度分別為22.5%、32.2%，可能與所選病例數、痰液性狀等因素有關。另外，楊新宇等[23]的研究結果顯示，無論是痰涂片或痰培養結果，合格痰標本的陽性檢出率及量化分級指標均遠遠高于不合格標本。

將T-SPOT.TB、結核抗體、痰涂片、痰培養聯合檢測用于活動性肺結核的診斷，可起到互補作用，其中T-SPOT.TB避免了接種過卡介苗可能存在的抗原交叉反應，有較高特異度，結合結核抗體檢測后從體液免疫與細胞免疫方面進行檢測，再聯合傳統的痰涂片與痰培養檢測，對提高診斷準確率有互補作用。

綜上所述，T-SPOT.TB、結核抗體聯合痰涂片、痰培養檢測在活動性肺結核診斷中有較高的臨床意義，可提高診斷敏感度、特異度、準確度。

本研究的不足之處是未將結核分枝桿菌核酸檢測技術納入評價體系。隨著結核分枝桿菌核酸檢測技術的普及應用，筆者建議今后可以系統評估結核分枝桿菌核酸檢測技術及免疫學檢查方法聯合應用，對診斷活動性肺結核，尤其是病原學陰性肺結核的價值及成本，提出適合不同情況的最優診斷流程。