125株耐多藥結核分枝桿菌的吡嗪酰胺耐藥及pncA基因突變分析

趙永 林淑芳 林建 戴志松 魏淑貞

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是重要的一線抗結核藥物，能夠殺滅在吞噬細胞內處于半休眠狀態(tài)的結核分枝桿菌。同時PZA能夠抑制核糖體蛋白S1的反式翻譯過程，從而阻止結核分枝桿菌產生賴以生存的其他蛋白質?；谶@些作用，PZA與異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)聯合治療可以有效縮短數個月的療程[1]。雖然Zhang等[2]和Li等[3]的研究均顯示，PZA耐藥與rpsA和panD基因突變有一定關系,但Dillon等[4]的研究證明了這2個基因的突變與PZA耐藥無關。 結核分枝桿菌PZA耐藥主要是由于吡嗪酰胺酶的編碼基因pncA發(fā)生突變，導致吡嗪酰胺酶的活性下降或失活，不能將PZA轉化成吡嗪酸。一些研究顯示，pncA基因突變具有多態(tài)性和地區(qū)差異性[5-9]。林淑芳等[10]和周銀發(fā)等[11]報道福建省耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株對PZA的耐藥問題比較嚴重，特別是對鏈霉素(Sm)和乙胺丁醇(EMB)耐藥的耐多藥結核病患者對PZA耐藥率較高。為了解福建省耐多藥結核分枝桿菌對PZA耐藥性及pncA基因的突變情況，為PZA耐藥的快速分子診斷提供依據，本研究通過隨機選取2010—2019年耐藥監(jiān)測點的125株耐多藥結核分枝桿菌進行PZA液體藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，并對PZA 耐藥相關基因pncA進行測序。

材料和方法

一、研究對象

采用簡單隨機抽樣的方法選取2010—2019年福建省9個耐藥監(jiān)測點的125株耐多藥結核分枝桿菌，標準株H37Rv由中國疾病預防控制中心國家結核病參比室提供。125株耐多藥結核分枝桿菌分離自125例耐多藥患者，其中男性占76.0%(95例)，女性占24.0%(30例)；年齡15～80歲，平均年齡(45.66±13.30)歲；初治患者65例(52.0%)，復治患者60例(48.0%)。

二、研究方法

1.菌種初步鑒定：采用對硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼(PNB/TCH)生長試驗法進行菌種初步鑒定，鑒別培養(yǎng)基濃度分別為PNB 500 μg/ml，TCH 5 μg/ml。若PNB和TCH培養(yǎng)基上均有菌生長，則判定為非結核分枝桿菌(NTM)，若PNB培養(yǎng)基上無菌生長、TCH培養(yǎng)基有菌生長則判定為結核分枝桿菌。

2.藥敏試驗：采用比例法固體藥敏試驗，具體操作參照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》[12]。對照培養(yǎng)基為中性改良羅氏培養(yǎng)基，6種含藥培養(yǎng)基的濃度分別為：異煙肼(INH)0.2 μg/ml，利福平(RFP)40 μg/ml，鏈霉素(Sm)4 μg/ml，乙胺丁醇(EMB)2 μg/ml，卡那霉素(Km)30 μg/ml，氧氟沙星(Ofx)4 μg/ml。若耐藥百分比≥1%，則認為受試菌對該藥耐藥。若耐藥百分比<1%，則認為受試菌對該藥敏感。耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數/對照培養(yǎng)基上生長的菌落數×100%。鑒于PZA需要在酸性環(huán)境(pH≤5.6)中才能更好發(fā)揮抗菌活性而結核分枝桿菌在酸性環(huán)境中生長不良，常規(guī)的固體藥敏試驗不適用于PZA耐藥性檢測。因此，本研究采用BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)對125株耐多藥結核分枝桿菌菌株進行液體培養(yǎng)，報陽后第1～5天內用PZA試劑盒(美國BD公司)進行藥敏試驗，PZA的臨界濃度為100 μg/ml，按照試劑盒說明書進行操作，4～21 d內得出結果，超出此時間范圍需重做，同時每批次使用標準株H37Rv作為質控株。

3.DNA提?。何?00 μl菌液到1.5 ml的EP管當中，蓋緊蓋子，85 ℃水浴1 h，12 000 r/min離心5 min，離心半徑4 cm，去掉上清，加入200 μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液，95 ℃金屬浴15 min，吸取上清液到新的離心管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

4.引物設計和PCR擴增： 從www.ncbi.nih.nlm.cn下載結核分枝桿菌標準株H37Rv的pncA基因序列，用Primer 5.0設計引物，引物序列為：正向：5′-GCGTCATGGACCCTATATC-3′；反向：5′-AACAGTTCATCCCGGTTC-3′。PCR反應體積為50 μl，其中2×Mix液為25 μl，DNA模板5 μl，去離子水20 μl。PCR反應程序如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃再延伸8 min。

5.PCR-DNA測序及分析：取PCR反應產物5 μl，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增條帶為目的條帶后，PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化、測序。將測序結果提交NCBI網站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比較。

6.質量控制：福建省結核病參比室每年均參加并通過國家結核病參比室組織的藥敏熟練度測試和分子檢測能力驗證。每批次藥敏試驗以標準菌株H37Rv作為對照。每次PCR擴增以H37Rv作為陽性對照，以去離子水作為陰性對照。對于PZA表型耐藥和pncA基因突變不一致的菌株，重復進行PZA液體藥敏測定。

三、統計學處理

通過Excel 2007軟件錄入研究數據，采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以“百分率(%)或構成比(%)”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、PZA的藥敏試驗結果

125株耐多藥結核分枝桿菌菌株對PZA耐藥的有50株， PZA耐藥率為40.0%(50/125)。男性患者PZA耐藥率為39.0%(37/95)，女性患者PZA耐藥率為43.3%(13/30)，差異無統計學意義；15～25歲組患者PZA耐藥率為58.3%(7/12)，26～45歲組患者PZA耐藥率為32.7%(16/49)，46～60歲組患者PZA耐藥率為39.5%(17/43)，61～80歲組患者PZA耐藥率為47.6%(10/21)，年齡組之間差異無統計學意義；初治患者PZA耐藥率為41.5%(21/65)，復治患者PZA耐藥率為38.3%(23/60)，差異無統計學意義，見表1。

表1 125例患者的基本特征與吡嗪酰胺耐藥性分析 [例(構成比，%)]

二、PZA耐藥株的pncA基因突變情況

50株PZA耐藥的耐多藥結核分枝桿菌中有30株檢出pncA基因突變，突變檢出率為60.0%(30/50)。PZA耐藥株的pncA基因突變檢出率高于PZA敏感株的pncA基因突變檢出率[5.3%(4/75)]，差異有統計學意義(χ2=45.276，P=0.000)。30株PZA耐藥菌株的pncA基因突變類型有22種，突變形式有點突變和移碼突變，其中以點突變?yōu)橹鳎?1.8%(18/22),突變頻率相對高的位點是311(G→T)，其次是202(T→C)，PZA耐藥株的pncA基因突變位點分散，堿基突變相對集中的區(qū)域在132～152(5株)、202～246(6株)、311～331(5株)、403～490(8株)。見表2。

表2 吡嗪酰胺耐藥的耐多藥結核分枝桿菌pncA基因突變情況

三、pncA基因測序檢測菌株耐藥性的效能

若以PZA表型液體藥敏試驗結果作為標準，pncA基因測序檢測PZA耐藥的敏感度為60.0%(30/50)，特異度為94.7%(71/75)，陽性預測值為85.7%(30/35)，陰性預測值為78.9%(71/90)。

討 論

PZA只在體外酸性環(huán)境或巨噬細胞里才能發(fā)揮其抗結核的作用，對體外培養(yǎng)基酸堿度的特殊要求限制了PZA藥敏試驗在臨床實驗室的常規(guī)開展。應用BACTEC MGIT 960 進行PZA液體藥敏檢測是目前檢測PZA 耐藥性較為可靠的方法之一。 由于PZA藥敏試驗的操作相對復雜、成本高，以及結果準確性等問題，WHO未將其納入常規(guī)藥敏檢測的要求當中。因此，臨床上往往未行PZA耐藥性檢測就將PZA用于結核病治療。 隨著分子生物學技術在結核病診斷中的應用，簡便經濟、準確可靠的快速分子診斷技術成了研究的熱點。通過檢測PZA耐藥相關基因的突變進行判斷PZA耐藥的分子藥敏也受到廣大學者的格外青睞。

本研究結果顯示，125株耐多藥結核分枝桿菌的PZA耐藥率為40.0%(50/125)，這與之前福建省周銀發(fā)等[11]報道的研究結果相仿，低于廣東地區(qū)的結果(58.5%)[7]和重慶地區(qū)的結果(62.4%)[8]?？梢?，不同地區(qū)PZA耐藥率的差異可能與研究對象的來源有關。本研究的研究對象均來自耐藥監(jiān)測點，廣東、重慶地區(qū)的研究對象來自?？漆t(yī)院，一般專科醫(yī)院的結核病患者病情及用藥史會更復雜。另外，本研究結果顯示，PZA耐藥率在性別、年齡組的分布差異均無統計學意義，說明患者的性別、年齡可能與PZA耐藥性無關。

Ramirez-Busby和Valafar[13]及Miotto等[14]的研究表明，結核分枝桿菌pncA基因突變導致吡嗪酰胺酶活性喪失或降低，不能將PZA轉變成吡嗪酸進而產生耐藥。結核分枝桿菌pncA基因突變大多數為點突變，少數為插入或缺失突變。本研究結果顯示，PZA耐藥的耐多藥結核分枝桿菌pncA基因突變率為60.0%，低于關平[7]報道的65.7%和羅振華等[5]報道的96%，進一步反映了pncA基因突變率因地而異的特點。另外，本研究結果顯示，PZA耐藥的pncA基因突變檢出率明顯高于PZA敏感株的pncA基因突變檢出率，說明pncA基因突變與PZA耐藥存在一定的關系。PZA耐藥的pncA基因突變類型有22種，突變形式主要以點突變?yōu)橹?占81.8%)，突變頻率比較高的位點是311G→T，其次是202T→C。Sheen等[6]研究報道，pncA基因突變分布于整個基因，且發(fā)生在相對集中的區(qū)域。經比對分析，本研究PZA耐藥株的pncA基因突變位點分散，堿基突變相對集中的區(qū)域在132～152(5株)、202～246(6株)、311～331(5株)、403～490(8株)。pncA基因堿基突變位點區(qū)域202～246、311～331、403～490與Zhang等[2]及朱大冕等[8]報道的PZA耐藥株突變集中區(qū)域為185～226、203～289、309～396、392～408和413～467的結果類似又有所不同，一方面體現了該基因突變因地區(qū)而異的多樣性，另一方面可能與各地區(qū)耐藥患者的用藥情況及依從性有關。本研究中pncA突變類型有29A→C、403A→C、490T→C，據Sheen 等[6]報道這三個突變與PZA耐藥高度相關。本研究pncA基因預測PZA耐藥性的效能特別是敏感度相對低一些，特異度較高，可能與PZA耐藥還存在其他耐藥機制有關。

總之，本研究中125株耐多藥結核分枝桿菌對PZA的耐藥率為40.0%，pncA突變檢出率為60.0%，通過檢測pncA基因及其啟動子區(qū)的序列突變來診斷結核分枝桿菌對PZA耐藥的真實價值有待進一步擴大樣本量及進行多中心的驗證評估。因此，有條件的地區(qū)應進行PZA藥敏試驗。40%對PZA耐藥的耐多藥菌株未檢測出pncA基因突變，說明PZA耐藥可能還存在其他耐藥機制，需要在今后的工作中進一步探究。

本研究存在一定的不足，首先是對患者信息尤其是臨床特征方面的資料收集不夠全面，因此對PZA耐藥的分析不夠全面，今后需收集更加齊全的資料進行詳述；其次是樣本量不夠大。另外，對PZA耐藥基因的選取存在一定的局限性，未對PZA其他耐藥相關基因如rpsA及panD基因的序列進行比對分析，未來將進一步采取基因組學方法等尋找更多的耐藥相關基因或位點。